analyses des acides nucléique

[invite1cb7552b]

Afin d'extraire l'ADN PLASMIDIQUE un groupe de travail a :
1. Inoculé 5ml de bouillon LB à partir d'une colonie isolée sur milieu gélosé
2. incubé ce bouillon une nuit à37°C.
3. centrifugé 1ml de culture pendant 2 minutes à vitesse maximale,
3. resuspendre le culot dans 1ml de tampon B
4. incuber 1heure à 37°C.
6. Centrifuger 30secondes à vitesse maximales.
7. Resuspendre le culot dans 40microlitre de tampon A.
Lyse et purification de l’ADN plasmidique
1. Transférer la suspension bactériennes (40microlitre) en tampon A dans un tube eppendorf contenant 600microlitrede la solution de lyse (tampon c).
2. Mélanger immédiatement en inversant doucement les tubes 2à 3 fois.
3. Incuber les tubes à 37°c pendant 20minutes .a cette étape la solution doit être claire et visqueuse.
4. Neutraliser en ajoutant 30microlitre de tamponD.
5. Mélanger comme en 2 .la solution doit devenir beaucoup moins visqueuse pratiquement aussi liquide que l’eau l’absence de changement significatif de la viscosité est généralement due à une dénaturation insuffisante de l’ADN du fait d’un pH trop bas de la solution de lyse.
6. Ajouté 160microlitre de tampon E.
7. Mélanger comme écrit en 2 .un précipité floculant blanc doit immédiatement apparaitre.
8. Incuber les tubes dans la glace pendant 1 heure.
9. Centrifuger 5 minutes à vitesse maximale.
10. Décanter le surnageant (500à600microlitre) dans un autre tube eppendorf à l’aide d’une micropipette (ne pas prélever de matériel précipité).
11. Ajouter 550microlitre d’isopropanole pré refroidir à -20°c.
12. Mélanger comme décrit en 2.
13. Incuber les tubes 30minutes à -20°c
14. Centrifuger 3minute à vitesse maximale ; un culot est généralement visible à cette étape.
15. Décanter en inversant les tubes, et garder les tubes retournés sur un mouchoir en papier.
16. Sécher les parois du tube avec un coton-tige ; ne pas toucher le culot et éviter que le liquide présent sur la paroi ne revienne en contacte avec le culot.
17. Sécher le culot pendant 90sec.
18. Reprendre les culots dans 40microlitre de tampon A.
19. Pipeter et refouler 2 fois à l’aide d’un cône jaune eppendorf coupé à 7mm de l’extrémité inférieure.
20. Analyser tout ou partie de l’échantillon par électrophorèse en gel d’agaro

les tampon utilisé contient :
Tampon E :
Nacl 5M
Tampon D :
Tris-HCL 2M
Ajuster à pH 7avec HCL
Tampon A :
Tris-HCL 0.05M
EDTA 0.01M
Ajuster à pH 8avec HCL
Tampon C :
Tris-HCL 0.05M
EDTA 0.01M
Ajuster à pH 12.42avec NaOH puis ajouté du SDS à une concentration finale de 4%

le tampon B CONTIENT :
Tris-HCL 0.05M
EDTA
ajuster à pH 8 avec HCL
SACCHAROSE 25%
LYSOZYME 20mg/ml
pourquoi on a utilisé ces températures?
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[MaliciaR]

Bonjour,

On avait déjà répondu sur ce protocole précisément , ici : http://forums.futura-sciences.com/thread214634.html


Cordialement,

[IngDr]

Tellement de précisions pour décrire l'énoncé, et une question si courte dommage... Quelles températures ? Comme tu t'es donné du mal pour tout taper, je vais te répondre.
37° pour les cultues : les bactéries d'E.Coli poussent bien à 37°C, comme dans notre intestin
37° pour le tampon B : il y a deja eu un post sur l'interet du lysozyme. C'est une enzyme, donc plus efficace vers 37° qu'à 4°C.
37° pour la solution A : lyse SDS/NaOH pour dénaturer les protéines, et extraire les plasmides. Le SDS précipitant à 4°C, c'est mieux à température ambiente ou 37
Dans la glace avec la solution E : comme je l'ai dit, le SDS précipite au froid. De meme éventuellement,comme on est en présence de sels, les protéines aussi, ainsi que les longs acides nucléiques (comme l'ADN génomique). Les plasmides restent en suspension.
Isopropanol à -20°C: ca fait partie du mythe, la précipitation des acidse nucléiques se faisant tradtionnellement en froid dans un alcool. S'il y a suffisement d'ADN, la précipitation se fait tres bien à température ambiante aussi.
Les lavages dans ce cas se font aussi à -20. Etonnant car d'habitude on passe à température ambiente car les sels sont plus solubles à cette température qu'à -20°C.

Edit : MaliciaR t'a été plus rapide.
Edit2 : Selmabio, en plus c'est toi qui avait déjà posé la question.... J'ai été trop gentil ce soir.