Problème en clivant mon peptide

[Zellus]

Bonsoir tout le monde !

Je fais appel à vous en espérant que quelqu'un puisse m'aider.

Mon problème est le suivant :

Dans le labo où je bosse, j'essaie de purifier un peptide par chromatographie FPLC. Ce peptide est fusionné en N-ter avec une GST, ce qui me permet de fixer ma protéine de fusion sur une colonne de GSH sépharose. Par la suite, je clive mon peptide sur la colonne en injectant de la TEV qui coupe entre ma GST et mon peptide.
Quand je lave, mon peptide et ma TEV tombent tous les deux. La TEV a un tag 6His qui lui permet d'être retenue par une seconde colonne de Ni2+-NTA, et mon peptide tombe seul dans mes tubes de collecte.

Tout va bien jusqu'à ce que j'analyse sur gel SDS-PAGE. J'observe bien mon peptide dans les fractions attendues, mais le soucis c'est que la plus grosse partie de mon peptide je la retrouve dans la fraction correspondant à l'élution de la TEV.

Si vous voyez un moyen de remédier à ce problème je suis preneur ^^.
Merci d'avance à tous.
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[Zellus]

Salut,

Personne n'a jamais eu ce problème alors ?
snif...

[invitebe208abd]

salut,

ton peptide ne contiendrait pas qlq HIS dans sa sequence, qui feraient que celui ci soit retenu egalement par la colonne Ni-NTA?

[Zellus]

Salut,

Désolé de ne pas avoir répondu plutôt mais j'ai eu des problèmes avec ma freebox.
Mon peptide a en effet 3 histidines dont 2 qui se suivent. Tu penses que c'est suffisant ? Je pensais qu'il en fallait au moins 3 ou 4 à la suite pour qu'il y ait fixation ...
En tout cas merci d'avoir répondu pas_douée

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitebe208abd]

Salut,

je suis pas sure que ça soit ça mais je ne vois pas autre chose. Soit tu trouves une autre methode de séparation de la TEV et ton peptide, genre colonne echangeuse d'ion si c est possible, soit lors de l'élution de la TEV (tu utilises peut etre de l'imidazole) procedes par des quantités croissantes de competiteur en commençant par des concentrations tres faibles, si ton peptide est fixé grace à ses HIS tu le récupère plus facilement avec des conditions de stringence faibles. Sinon je sais pas....

[Zellus]

Bonjour,

Je pense que tu as raison en fait et que 2 histidines suffisent pour la fixation, d'après ce que j'ai pu voir sur le net comme ça : http://www.nanoprobes.com/Images/2080.gif
Faut que je vois avec mon chef ce qu'on va faire mais les idées de l'échangeuse d'ions ou du gradient d'imidazole sont très bonnes.
Merci encore d'avoir répondu.

Salut !!