RTQPCR ou RT+QPCR

[invite02cefc91]

Bonjour à tous.

Me voilà de retour avec mes questions sur la Q-PCR.

Maintenant que vous m'avez aidé à résoudre mon problème de quantité d'ARN, de concentration de mes primers .... Je me posais la question de faire soit un RTQPCR one step ou de faire la RT et la QPCR de façon séparée.

Je me demande laquelle est la plus approprié, j'imagine que chacune a ses avantages et inconvénients. Hier je suis allé à une sois disant formation QPCR par Biorad qui a vite tournée en "Biorad c'est mieux que les autres' (en même temps cela était évident", et je me suis cette questions.


Vous faites comment vous vos PCR Q ?


Merci de vos témoignages


A plus
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[piwi]

L'intérêt de faire une RT puis une PCR est de pouvoir normaliser les concentration en cDNA avant de se lancer dans les séries de PCR importantes.
Le one step empêche cela si bien que vous n'avez jamais vraiment la même quantité de cDNA dans les tubes.

Donc pour moi c'est RT puis PCR.

[invite8c1e373f]

Bonjour

+1 avec piwi : RT puis PCR.
Ca permet également de pouvoir vérifier que la RT s'est bien déroulée.
C'est aussi nécessaire quand on fait des PCR sur des cibles différentes. Je préfère partir du même lot de cDNA.

[invite02cefc91]

Effectivement, j'y avais pas pensé. C'est une bonne raison

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite8c0cc995]

En ce qui concerne ton formation, ils étaient loin d'être les meilleurs il y a quelques années... Surtout niveau reproductibilité

Si on met la meme quantité d'ARN initialement pour le one step, c'est normalisé par la quantité d'ARN initiaux, et comme de toute facon vous normalisez par un gène de référence, c'est ok. En plus la logique veut que l'on passe l'échantillon plusieurs fois en RTQPCR, donc s'il y a un problème une fois dans une one step, cela doit se voir au niveau de la reproductibilité.
Fut un temps, je faisais du 2 step, puis du one step, et maintenant je refais du 2 step. Le one step est plus simple, et rapide, car on met une fois dans son tube et c'est joué. Le désavantage, c'est qu'on travaille toujours sur les ARN quand on lance la manip, donc il faut ête super minutieux pour pas les flinguer. En revanche avec le 2 step, on peut se faire un stock de cDNA à utiliser pour les QPCR. Par contre, il y a toujours un risque accru de contamination car les échantillons sont plus manipulés, et de même rien ne garantie à 100% que la RT se soit déroulée de la même manière dans tous les tubes, donc pourquoi ne pas faire du one step.
Outre le one step et 2 step, la question qui doit se poser est : "quelle type de primer pour la RT ? OligodT, random, primer spécifique ?" Car avec du one step et primer spéficique vous pouvez détecter en général des ARN en plus faible quantité.
Après comme bien souvent, il y a autant de pratiques différentes que de labo, en fonction du type de gènes testés, de leur expression, de la présence de structures secondaires dans l'ARN, etc...

[inviteb6144ea4]

Bonjour,

pour moi aussi c'est RT puis QPCR pour toutes les raisons citées avant.

Après comme bien souvent, il y a autant de pratiques différentes que de labo, en fonction du type de gènes testés, de leur expression, de la présence de structures secondaires dans l'ARN, etc...

Bien d'accord avec toi!