QPCR, courbe Tm?

[inviteb17afb19]

Bonjour à tous!


Voilà je suis débutante en QPCR et je ne sais pas comment interpréter mes données...
J'utilise le sybergreen et GAPDH comme controle, et la machine c'est celle de Roche (m'en demander pas plus je ne suis plus au labo là alors je n'ai pas les ref!)
mon but est de tester l'expression d'une ARN particulier dans des C6 suite à l'utilisation de Sh ou non pour l'inhiber.
Lorsque je réalise l'analyse par le logiciel de la machine, la comparaison des ratios entre mes échantillons et le controle GAPDH est tout à fait honorable et satisfaisant! et j'aurai donc bien un effet de mon Sh
Cependant, lorsque je regarde les courbes de Tm (qui si j'ai bien suivi traduisent la spécificité des primers) il se trouve que celles de GAPDH sont parfaites, alors que celle pour mon ARN sont complètement désorganisées (rien ne se superpose vraiment et il y a plusieurs sommets de courbe)
Donc là vous allez me dire : "tes primers ne sont pas bons!!!!"
Hors il se trouve qu'on les a déjà utilisé avant et que ces courbes étaient impeccables pour mon ARN aussi Donc j'aimerai savoir comment expliquer cette différence?qu'est ce qui a bien pu se passer? et est ce que je dois réellement tenir compte de ces courbes Tm ?
J'ai oublié aussi de dire que ma courbe standard de ref pour mon ARN (comparé à celle de GAPDH) n'est pas tip top et ne comporte que 3 points... cela peut il etre une des causes du problème pour la création des courbes pas le logiciel? (ce que je doute)

voilà merci de m'éclairer si c'est possible
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[invite74665166]

bonsoir,
vue que tu ais en sybergreen tu dois tenir compte de tes courbes de Tm car c'est elle qui t'indique la spécificité de ta PCR.
Quand tu dis que tu as deja testé tes primers c'etais sur une gamme a partire d'une dilution de plasmide ou d'un ARN extrait?

[gorben]

Salut,

Donc j'aimerai savoir comment expliquer cette différence?qu'est ce qui a bien pu se passer? et est ce que je dois réellement tenir compte de ces courbes Tm ?

Beaucoups de choses peuvent expliquer ca. Ca va des primers pourris, a une annealing trop basse, [sels] trop importante, pas assez de materiel (ARN/cDNA), mauvaise concentration de primers etc...

Si ces primers sont connus pour etre bons, (teste par ton labo avec courbe de fusion a l'appuis ou publie et sans moyen de regarder les courbes?), alors c'est soit quelque chose qui a change dans ta manip (origine du mix? annealing? concentration des primers? etc) et si ce n'est pas le cas, c'est que soit tes primers sont devenus mauvais avec le temp (ou contamine par quelque chose) soit que ton ARN/cDNA est different et qu'il requiert une optimisation (genre quantite d'ARN plus faible, du coup moins de cDNA, du coup les primers sénnuient et se dimerisent )

J'ai oublié aussi de dire que ma courbe standard de ref pour mon ARN (comparé à celle de GAPDH) n'est pas tip top et ne comporte que 3 points... cela peut il etre une des causes du problème pour la création des courbes pas le logiciel? (ce que je doute)

Ca n'a rien a voir, la courbe de fusion n'est pas dependante de ta gamme etalon. Par contre ta gamme etalon doit comporter plus de 3 points (au moins 6 a 7 log) et elle pourra te renseigner si c'est un probleme de quantite de template ou pas !

Attention a la qPCR, c'est bien comme methode mais il faut etre certain que les controles soient parfait, sinon les resultats peuvent vraiment dire n'importe quoi (meme si c'est ceux que l'ont attend !!!)

A+ bon courage

[inviteb17afb19]

Salut

bonsoir,
vue que tu ais en sybergreen tu dois tenir compte de tes courbes de Tm car c'est elle qui t'indique la spécificité de ta PCR.
Quand tu dis que tu as deja testé tes primers c'etais sur une gamme a partire d'une dilution de plasmide ou d'un ARN extrait?

Oui ils avaient été fait auparavant par mon labo sur les memes types échantillons d'ADNc que moi ...

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteb17afb19]

Bonjour

merci pour vos réponses rapides!!

Si ces primers sont connus pour etre bons, (teste par ton labo avec courbe de fusion a l'appuis ou publie et sans moyen de regarder les courbes?), alors c'est soit quelque chose qui a change dans ta manip (origine du mix? annealing? concentration des primers? etc) et si ce n'est pas le cas, c'est que soit tes primers sont devenus mauvais avec le temp (ou contamine par quelque chose) soit que ton ARN/cDNA est different et qu'il requiert une optimisation (genre quantite d'ARN plus faible, du coup moins de cDNA, du coup les primers sénnuient et se dimerisent )

Oui c'est ce qu'on pense ici aussi... pour ce qui est des mix utilisés normalement pas de soucis car j'ai tout fait en parallèle avec quelqu'un d'autre pour qui les courbes Tm sont nickels (pas les meme primers) donc je dirai que les primers ont un problème....

oui oui je sais bien que la qPCR demande des controles parfaits... c'est bien pour ca que je m'inquiétais!!
bon ben va falloir recommencer tout ca...
encore merci

[inviteb17afb19]

Re - bonjour à tous!

Après avoir passé la matinée à réfléchir au problème au labo, il s'est avéré qu'on m'a donné les primers qui n'était pas à la bonne dilution!!!
ce qui fait que je les ai utilisé à 20µM au lieu de 10µM
Cela peut il expliquer les variations des courbes de Tm? le surplus de primers aurait il pu faire qu'ils se dimérisent entre eux?!?!

Sinon on envisage de refaire nos ADNc à partir de nos ARN qui étaient correct (en utilisant un autre kit du labo qui marche très bien) et en utilisant cette fois ci la bonne dilution des primers!
est ce que cela vous semble judicieux?
ou bien faudrait-il carrément changer de primers?
je deviens folle!

merci d'avance!

[invite8c0cc995]

Pourrais tu mettre l'appercu d'écran des courbes de fusions, car en fait, un dimere de primer a souvent une température de fusion plus basse que le produit spécifique, ce qui se traduit par 2 pics distincts si les Tm sont différents (au fait, quelle est la taille attendue du produit d'amplification spécifique?)
As tu vérifié que rien n'a été modifié dans le programme du Lightcycler concernant le nombre de cycles de PCR, l'étape de fusion (en particulier la vitesse de variation de température en °/s ou le nombre d'acquisition par seconde (sur LC480)) par rapport aux manips où les courbes de fusion étaient OK ?

Sinon il faut éviter les congélation/décongélation trop fréquentes des primers, cela influe beaucoup sur le résultat de qPCR. L'idéal dans ton cas serait de refaire la dilution de primer à partir du stock si celui ci est récent, sinon de recommander des primers.

Sinon, nous avons observé qu'un doublement de la concentration de primer peut influer dans certains cas sur l'efficacité de PCR. Et comme dit plus haut, en fonction des conditions réactionnelles (quantité de matrice, quantité d'amorces, température), cela peut suffire à créer des dimères, mais ce n'est pas systématique pour tous les couples d'amorces/gènes testés

[inviteb17afb19]

bonjour, de retour dans ma manip de QPCR (j'avais besoin de faire autre chose)
voilà donc les apercus écranan des courbes de fusion : celle qui semble la mieux , c'est mon controle GAPDH, et l'autre c'est mon gène d'interet

en ce qui concerne le programme j'ai bien vérifié, et rien n'a changé...

Nous avons recommandé des primers....
on verra bien!

merci!

[invite8c0cc995]

la courbe donne quoi pour la gamme standard ?, est ce qu'en dessous d'une certaine concentration la courbe de fusion donne des produits aspécifiques ?
Pour vous aider, si vous avez des dimères de primers, ils se retrouvent aussi dans le controle PCR sans ADN. Ca vous permettra de savoir si les pics surnuméraires sont des dimers ou non.