Bonjour bonjour
dites, nous avons un ptit souci...
lors de notre électrophorèse d'acides nucléiques sur gel d'agarose 2% nous
avons mis du bromure d'éthidium dans le gel (TAE+ Agarose)
mais pas dans le tampon de migration (TAE), - sous indication de l'assistant-
contrairement à ce qui était indiqué dans le protocole de départ...
L'assistant ne nous ayant pas dit pourquoi je lance un sos cri de désespoir: qu'a
ce bromure d'éthidium comme effet sur la migration???
Merciiii
Em+Cé
Ne t'en fais pas!
Si ton collègue t'a dit de ne pas mettre de BEt dans le TAE de la cuve, c'est qu'il suffit d'en mettre (un tout petit peu) dans le gel pour colorer les ADN.
Bonsoir,
Le bromure d'éthidium sert uniquement à visualiser l'ADN sur le gel d'agarose. Il n'intervient pas dans la migration de l'ADN.
En mettre dans le gel est suffisant pour voir aux UV les bandes d'ADN. Le problème de l'éthidium, c'est qu'il est chargé positivement et il migre donc dans le sens opposé à l'ADN. Si vous laissez migrer trop longtemps votre ADN, il peut ne plus y avoir assez d'éthidium dans le bas de votre gel et vous risquez de ne plus voir les bandes de faible masse moléculaire (vous devez d'ailleurs avoir des petits fragments vu que vous utilisez un gel à 2% non ?).
Le fait de rajouter du bromure d'éthidium (BEt) dans le tampon de migration va permettre à l'éthidium du gel d'être remplacé par celui du tampon. Comme ça vous avez plus de chance de voir vos bandes.
Pour résumer, vous n'êtes pas obligé de mettre du BEt dans le tampon de migration. Avez-vous vu vos bandes quand vous en avez mis uniquement dans le gel ?
Merci pour vos si promptes réponses !
En effet, l'électrohporèse était courte pour éviter que le bromure d'éthidium ne délocalise des acides nucléiques...et je comprends donc pourquoi nous n'en n'avons pas ajouté au tampon de migration!!
Chouette, ce forum !!
Bonjour,
Je ne comprends pas trop là... Si l'on lit ce paragraphe, il est en contradiction avec ce que tu disais plus haut. Pour moi, à la vue de ce paragraphe, j'aurais l'idée que l'ajout de BET dans le tampon de migration va améliorer la visualisation des bandesEnvoyé par Zellus
Gniii? Comment ça, je ne comprends pas
Cordialement,
Bonjour,
Je disais que du BEt dans le gel suffit généralement pour voir les bandes. Mais comme l'éthidium est positif, il migre vers les puits du gel ("haut du gel"), et s'il y a des bandes à visualiser dans le bas du gel, il risque de ne plus y avoir assez de BEt à cet endroit.Je ne comprends pas trop là... Si l'on lit ce paragraphe, il est en contradiction avec ce que tu disais plus haut. Pour moi, à la vue de ce paragraphe, j'aurais l'idée que l'ajout de BET dans le tampon de migration va améliorer la visualisation des bandes
Si on veut éviter que ça arrive, on peut rajouter du BEt dans le tampon de migration dans lequel baigne le gel. Du BEt du tampon va pénétrer dans le gel par simple diffusion, et il pourra remplacer celui qui va partir du bas du gel.
Mais c'est utile seulement si on laisse migrer longtemps son ADN.
Si vous avez perdu du signal en laissant trop migrer votre ADN et que vous n'avez pas mis de BEt dans le tampon de migration, vous pouvez également récupérer ce gel et le mettre dans un bain de tampon de migration + BEt + agitation. Il faut incuber pendant un bon moment quand même, donc s'il vous reste de l'échantillon ça peut être plus rapide de refaire un gel et d'en redéposer (en laissant moins migrer cette fois ou en mettant du BEt dans le tampon cette fois).
PS : Juste à titre indicatif, j'ai découvert cette année le SYBR Safe qui permet également de visualiser l'ADN sur gel. On ne visualise pas l'ADN aux UV mais avec une lumière bleue, ce qui évite les problèmes de dégradation de l'ADN par les UV. C'est une molécule qui a l'avantage d'être beaucoup moins (ou pas du tout ?) cancérigène que le BEt, et qui ne migre pas car pas chargé. Le truc c'est qu'il est peut-être plus cher que le BEt ... (?)
Hello,
Au risque d'être chiante, il y a des choses qui m'échappent dans ton raisonnement
Si je comprends bien, ici tu parles du cas où on ferait migrer des bandes de taille assez élevée (genre, > à 1.5 kb) et de taille aux environs de 100-300 pb. Le truc qui m'échappe est que je ne vois pas pourquoi on voudrait faire migrer ça longtemps. Pour bien séparer les petites bandes, on fait migrer dans des gels de concentration d'agarose plus élevée que lorsque l'on veut séparer des bandes de tailles plus élevées. De même, les temps de migration ne sont pas les mêmes.
Personnellement, je n'ai jamais entendu quelqu'un mettre du BET dans le tampon de migration, je n'ai jamais vu non plus de la perte de signal (en tout cas, visible) lorsque le BET est ajouté lors de la préparation du gel.
Là, c'est pareil, je ne comprends pas trop. Si la vitesse à laquelle le BET migre vers le haut du gel est supérieure à celle à laquelle il pénètre dans le gel, et surtout qu'on fait migrer pendant longtemps, in fine tous le BET se rettrouvera en-dehors de l'ADN...Si on veut éviter que ça arrive, on peut rajouter du BEt dans le tampon de migration dans lequel baigne le gel. Du BEt du tampon va pénétrer dans le gel par simple diffusion, et il pourra remplacer celui qui va partir du bas du gel.
Mais c'est utile seulement si on laisse migrer longtemps son ADN.
Oui, j'ai vu le site qui proposait ce produit. Il a vraiment l'air bien : pas cancérigène, ne provoque pas de mutations, n'a pas besoin de moyens spéciaux pour être éliminé (on connaît tous les bidons "Spécial BET"PS : Juste à titre indicatif, j'ai découvert cette année le SYBR Safe qui permet également de visualiser l'ADN sur gel. On ne visualise pas l'ADN aux UV mais avec une lumière bleue, ce qui évite les problèmes de dégradation de l'ADN par les UV. C'est une molécule qui a l'avantage d'être beaucoup moins (ou pas du tout ?) cancérigène que le BEt, et qui ne migre pas car pas chargé. Le truc c'est qu'il est peut-être plus cher que le BEt ... (?)). Dans mon labo, on réfléchit à en acheter, mais pour que ce soit rentable, il faut que tout le monde s'y mette : si l'on continue à dépenser de l'argent pour le traitement du BET mais qu'on paie un truc plus cher que le BET, ça risque d'être un peu bête
Cordialement,
Et si tu fais des restrictions? Tu n'as pas de gel idéal. Résultat, tu en fais un pas trop concentré et tu laisse migrer un moment.Le truc qui m'échappe est que je ne vois pas pourquoi on voudrait faire migrer ça longtemps. Pour bien séparer les petites bandes, on fait migrer dans des gels de concentration d'agarose plus élevée que lorsque l'on veut séparer des bandes de tailles plus élevées. De même, les temps de migration ne sont pas les mêmes.
Personnellement plutôt que de mettre du BET dans toute la cuve de migration je préfère le mettre dans le gel et si j'ai besoin de recolorer une bande trop basse qui est passée sous le front de BET je fais un bain dans une cuvette.
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Salut,
en général, j'ai souvent fait des migration sur gel d'agarose sans mettre de BET du tout. On faisait "tremper" un peu le gel dans une cuve avec du BET pendant qlq minutes avt de reveler.
Oui mais dans ce cas là tu utilises plus de BET que si tu le mettais directement dans le gel non?
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Oui ça c est sur Piwi, mais c'était en TP donc on etait plusieurs à se servir de la cuve, ça amortit! lol
Apparement il s'agissait d'éviter de que le BET n'interfere avec la migration.
Bonsoir,
Comme piwi l'a dit ça peut servir quand tu fais des restrictions, ou dans tout autre cas où tu à des bandes de tailles très variées.Le truc qui m'échappe est que je ne vois pas pourquoi on voudrait faire migrer ça longtemps.
Des fois, pour faire migrer beaucoup d'échantillons en même temps, tu mets 2 peignes dans ton gel pour avoir plus de puits (un à l'emplacement habituel et l'autre vers le milieu du gel). Et il arrive que tes échantillons du bas soient mal colorés à cause du BEt qui a migré vers le haut. Dans ce cas, il est bien aussi de rajouter du BEt dans la cuve ou d'incuber ton gel dans une cuve comme piwi.
Enfin, il arrive aussi que comme moi tu sois étourdi et tu oublies ton ADN qui est en train de migrer. Là aussi le BEt dans le tampon peut t'éviter d'avoir à tout refaire ...
T'inquiète ça migre pas si vite quand même. Et surtout, le plus important à retenir, c'est que dans la plupart des cas mettre du BEt dans le gel suffit largement.Là, c'est pareil, je ne comprends pas trop. Si la vitesse à laquelle le BET migre vers le haut du gel est supérieure à celle à laquelle il pénètre dans le gel, et surtout qu'on fait migrer pendant longtemps, in fine tous le BET se rettrouvera en-dehors de l'ADN...
Ah bon ? Remarque le BEt pourrait peut-être interférer avec la migration, mais il doit vraiment en falloir beaucoup pour que ça arrive ...Apparement il s'agissait d'éviter de que le BET n'interfere avec la migration.
Hello,
J'y avais vaguement pensé, le truc c'est que je n'ai jamais vu mes fragments de petite taille dans un gel lorsque je fais migrer des restrictions. Et ce n'est pas une question de concentration en agarose seulement. L'idée que j'avais derrière la tête (ou dedans, c'est selon
Je ne suis pas si étourdie : j'attends avec impatience que ça finisse pour avoir les résultatsEnfin, il arrive aussi que comme moi tu sois étourdi et tu oublies ton ADN qui est en train de migrer
Comment ça? Moi non plus, je ne comprends pasApparement il s'agissait d'éviter de que le BET n'interfere avec la migration.
Cordialement,
Salut,
Oui quand tu as des mélanges de tailles il est difficile de visualiser les grandes et les petites. Il faut arriver à doser la migration pour tout voir et éviter que les bandes de petites tailles sortent du gel. Le mieux serait d'avoir un gel assez allongé. Les colorants de migrations peuvent aussi bien aider et il en existe plusieurs qui migrent à différentes vitesses.J'y avais vaguement pensé, le truc c'est que je n'ai jamais vu mes fragments de petite taille dans un gel lorsque je fais migrer des restrictions. Et ce n'est pas une question de concentration en agarose seulement. L'idée que j'avais derrière la tête (ou dedans, c'est selon ), c'est que les petits migrent trop vite comparé aux grands, donc je me disais que, BET ou pas dans ton TAE de migration, les petits risquent de sortir avant que de correctement séparer les grands.
Si tu n'arrives pas à bien voir tes bandes dans le bas du gel (ou même dans tout le gel si tu n'as pas mis assez de BEt voire si tu l'as oubliéSinon, tu veux bien expliciter comment tu sauves la situation? Ca m'intéresse. Merci
Ah ok! C'est ainsi que je révèle mes gelsSi tu n'arrives pas à bien voir tes bandes dans le bas du gel (ou même dans tout le gel si tu n'as pas mis assez de BEt voire si tu l'as oublié
Merci pour l'explication, en tout cas
Cordialement,
Bonjour.
Moi j'ai une petite question qui me taraude l'esprit : le BET s'intercalant dans L'ADN et augmentant son pas ne fausse pas les résultats lors de la migration ?
Ca revient au même me direz vous si le PM est lui aussi soumis au BET ?
Merci.
Salut,
en ce qui concerne l interference du BET dan la migration, comme on voulait separer de l'ADN issu de digestion plasmidique, la conformation de l ADN est aussi importante (circulaire, linéaire, superenroulée) et je pense que le fait que le BET soit présent avant la migration et s'intercalle doit modifier un peu cette conformation?
Enfin c est peut etre ça mais je n'en suis plus sure, je me renseignerai la dessus la semaine prochaine.
Sinon on a l habitude de dire que le BET est un agent intercallant, mais j ai entendu dire qu il ne s'intercalle pas vraiment entre les bases,est ce que qlq un sait comment ça marche, parce que je n ai pas encore trouvé de reponse?
Merci, bonne journée
Salut,
Ca m'étonne parce que normalement le BEt ne gène pas la séparation des 3 formes du plasmide ...je pense que le fait que le BET soit présent avant la migration et s'intercalle doit modifier un peu cette conformation?
Autant que je sache, c'est bien en s'intercalant entre les bases qu'il agit.Sinon on a l habitude de dire que le BET est un agent intercallant, mais j ai entendu dire qu il ne s'intercalle pas vraiment entre les bases, est ce que qlq un sait comment ça marche, parce que je n ai pas encore trouvé de reponse?
Oui je te dirait ça.Ca revient au même me direz vous si le PM est lui aussi soumis au BET ?
Hello,
Idem. De toute façon, vu que ces trois formes sont traitées de la même manière (même exposition au BEt,...), le biais sera le même (si biais il y a; perso, ça me paraît très peu possible).
+1Autant que je sache, c'est bien en s'intercalant entre les bases qu'il agit.
Cordialement,
Bonjour
une heure, c'est pas un peu trop long ? n'y a t-il pas un risque de diffusion ?Si tu n'arrives pas à bien voir tes bandes dans le bas du gel (ou même dans tout le gel si tu n'as pas mis assez de BEt voire si tu l'as oublié
Il me semble que pour les séparations sur gel d'acrylamide, on fait des bains d'une durée bien plus courte (15 minutes). Enfin la diffusion n'est surement pas la même entre agarose et acryl (de même que l'épaisseur des gels).
Salut,
Ca dépend de la quantité de BEt que tu as dans ton bain. Je sais que si mon BEt est un peu vieillot, je laisserai 45 min -1h, en revanche si je viens de le préparer (10 gouttes de la solution concentrée commerciale dans 350 ml eau pyrolysée) 15-20 min suffit. Et aussi ça dépend de la quantité du dépôt. Quand je fais des quantif', je prépare du BEt frais et je laisse environ 1h pour que même le plus petit dépôt (celui contenant le moins d'ADN) puisse être bien coloré.
En revanche, je n'ai pas trop compris la question du risque de diffusion
Cordialement,
Oki merci pour les précisions, je n'ai jamais fait de coloration post-migration en agarose.
Pour la diffusion, c'est par rapport au risque d'avoir des bandes moins nettes à la photo.
Tu veux dire que l'ADN risquerait de diffuser?J'avoue ne pas trop suivre là
oui je parlais de la diffusion de l'ADN.
maintenant, c'est peut être minime du fait du maillage de l'agarose.
Je ne vois pas trop comment ce serait possible... Dans le sens où si diffusion devrait y avoir, elle se produirait déjà durant la migration, non? Ensuite, si je ne m'abuse, c'est le dye qui diffuse quand on traîne avec le dépôt
Cordialement,
Salut,
En une heure ton ADN n'a pas le temps de diffuser. Il faut attendre très longtemps pour que ça arrive. Et puis c'est un généticien qui m'a conseillé ça alors j'ai fait confiance.une heure, c'est pas un peu trop long ? n'y a t-il pas un risque de diffusion ?
C'est comme pour les protéines, mon chef m'a dit qu'au bout d'une heure tu n'a toujours pas de diffusion dans ton acrylamide. Il faut attendre 3-4 heures pour que ça commence à peine à diffuser.
Pendant la migration l'ADN est soumis à un champ électrique trop puissant pour pouvoiir diffuser. Il ne peut que suivre le mouvement. Et même ça dure pas des heures normalement ...Je ne vois pas trop comment ce serait possible... Dans le sens où si diffusion devrait y avoir, elle se produirait déjà durant la migration, non ?
Oui le BEt va diffuser plus vite que l'ADN vu qu'il est beaucoup plus petit.Ensuite, si je ne m'abuse, c'est le dye qui diffuse quand on traîne avec le dépôt , mais ses molécules sont nettement plus petites que celles de l
Oki, merci Zellus
C'est vrai que pour l'acryl, j'ai laissé des gels en cassette sur la nuit, la diffusion des ADN est minime, elle est plutôt gênante après 2-3 jours.
(toutefois ces gels étaient placés à -80°)
Bonsoir,
bon comme promis j ai mon explication pour l'utilisation du BET apres la migration seulement:
-on evite la contamination du materiel, de façon a pouvoir le manipuler tranquillement sans gant. De plus ça facilite l'elimination du BET.
-le BET migrant dans le sens opposé de l'ADN au bout d'un moment le BET "depasse" le debut des pistes et donc les tout petits fragment ne seront pas ou pas bien revelés.
-le BET introduit des supertours positifs, ce qui est tres genant pour la migration de digestions plasmidiques en ce qui concerne la forme I (surenroulée) qui est alors un peu "deroulée" et dont la bande sera plus rapprochée de celle correspondant à la forme III (lineaire).
Voilà c est les info que j ai
Bonne soirée
C'est vrai, mais tu dois manipuler une solution plus concentrée de BET pour colorer ton gel, puis le décolorer...
c'est vrai-le BET migrant dans le sens opposé de l'ADN au bout d'un moment le BET "depasse" le debut des pistes et donc les tout petits fragment ne seront pas ou pas bien revelés.
Si ton plasmide est digéré alors il n'est plus du tout superenroulé-le BET introduit des supertours positifs, ce qui est tres genant pour la migration de digestions plasmidiques en ce qui concerne la forme I (surenroulée) qui est alors un peu "deroulée" et dont la bande sera plus rapprochée de celle correspondant à la forme III (lineaire).
et je pense que personne n'estime la taille d'un plasmide en déposant de l'ADN superenroulé
Yoyo
Salut,
.....euh j ai pas tout saisi, comment on fait alors???je pense que personne n'estime la taille d'un plasmide en déposant de l'ADN superenroulé
Sinon, dans une digestion tout n est pas forcement coupé, d autant si on a des mutations, donc ça me parait important de pvoir localiser le l'ADN natif, non?
Bonne soirée
