Question purification QIAprep

[invite17a570c1]

Bonjour,

Malgré les rapports à écrire, il faut que les manips avancent un peu... J'ai envoyé mes plasmides recombinants à séquencer, mais la qualité de l'ADN n'était pas vraiment terrible. Ce que je ne comprends pas, c'est : pourquoi? Je fais des précultures avec mes antibios (kana et chloramphénicol) en milieu minimum sur lesquelles je fais les QIApreps (20 ml de préculture à DO600 = 1.5, sila DO est supérieure, j'ajuste la quantité : vive la règle de 3 ; j'ai un tampon d'élution un peu différent de celui fourni dans le kit : 5 mM Tris-HCl pH 8.5).
Mais malgré 3 essais, mes preps ont toujours des espèces de smears pénibles : soit c'est sale, soit il y a de la dégradation. Mais le hic est que ce n'est jamais les mêmes qui ont ces soucis Du coup, je ne comprends plus trop : comment se fait-il que dans les mêmes conditions expérimentales, j'ai des échantillons qui se comportent de manières différentes? Ce qui est aussi marrant c'est que j'ai testé un truc aujourd'hui : je n'avais pas ajouté de chloramphénicol à l'une des précultures et ... je n'avais pas de dégradation. Alors que la préculture contenant cet antibio avait la même tête moche et smear-euse

Quelqu'un aurait-il une idée du pourquoi?

Merci


Cordialement,
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[invitee8b3f97e]

Coucou !

Je ne sais pas si c'est ca, mais de mon côté quand les extractions de plasmides sont pas très jolies c'est souvent du au fait que les cultures sont trop vieilles. Essaye de faire l'extraction avec une DO plus basse (1.0 par exemple) et le même volume de culture. Ca évite de se retrouver avec de l'ADN chromosomique dans ton ADN plasmidique, qui peut être la cause des smears.

[invite17a570c1]

Coucou

Merci pour le conseil, je verrai bien ce que ça donne

Le truc que je ne m'explique pas trop c'est que quand je ne mets pas de chlormaphénicol, il n'y a pas de smears, c'est propre (même si la quantité de l'ADN plasmidique n'est pas vraiment terrible ). Je ne blinde pas avec des bactos non plus dans ce cas. Qu'est-ce que ce truc...?


Cordialement,

[piwi]

Il y a aussi la quantité de plasmides qui entre en compte. Je ne sais pas comment tu fais tes preps, nous, nous utilisons le kit Xtra midi. Le principe est une colonne et un filtre (classique pour ce genre de kit). Le truc c'est que si tu charges trop de bactéries tu satures la colonne et ton extraction n'est pas terrible. Je constate que presque paradoxalement j'ai de meilleurs résultats avec une petite quantité de bactéries qu'avec une grosse masse.

Pour les prep il faut aussi ne pas être trop violent, sinon tu peux passer de l'ADN génomique qui te pollue ton boulot. Je ne sais pas si ca donnerait un gros smear en revanche. Je ne pense pas ou alors en travaillant tout au vortex intensément

Sinon mes plasmides je les reprends dans l'eau, a mon avis le TE n'est pas nécessaire. Et pour peu qu'il soit un peu frelaté il va te faire suer plus qu'autre chose.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite17a570c1]

Ce n'est pas une midiprep, justement. Je me dis que si je veux utiliser les plasmides pour transfo ou des choses bien particulières, je ferai une midiprep. Mais pour le séquençage... Il suffit que ce soit propre, pas besoin de passer 2h sur la midiprep (Je sais, la flemmardise va me perdre... ).

Et pas de vortex du tout

Donc, conclusion générale : essayer avec moins de bactos.
Merci bien à vous deux


Cordialement,

[invite8c0cc995]

y a des souches de bactos plus riche en nucleases que d'autre (HB101 par ex).
certains kit proposent des etapes supplementaires de lavages de la membrane dans ce cas.
tes bactos sont resistantes kana et chloamphenicol ? les 2 sur plasmide ou 1 intégré au génome ?

[invite17a570c1]

Salut

La résistance à la Kana est sur plasmide, l'autre... Je ne sais pas, en fait, c'est stupide! Vu que la quantité de chloramphénicol que je mets est petite, je pense qu'il s'agit d'une résistance type "perméabilité membranaire réduite" et non pas d'un gène spécifique (cat, si je ne m'abuse). Ma souche est une dérivée de MC4100 avec une mutation ponctuelle dans malT mais c'est tout ce que l'on m'a signalé dessus... Quelle conséquence?

J'ai fait un lavage supplémentaire quand j'ai fait la manip hier... Et toujours pas top


Cordialement,

[gorben]

Salut,

Qu'est ce que tu appelles "petite quantitee de Cm"?
Si ta souche n'exprime pas une cat, ca s'explique facilement par le stress cause par ton Cm. Tu ajoutes un antibiotique pour lequel ta souche ne semble pas etre resistante (d'ailleurs si c'est pas pour conserver un plasmide, interroge toi sur le pourquoi de cette selection...), il va donc y avoir pleins de reponses dans la cellule, certaines peuvent effecter ton ADN plasmidique.

A+

[invite17a570c1]

Qu'est ce que tu appelles "petite quantitee de Cm"?

Ah oui, j'ai oublié de préciser le protocole Pour une culture de 40 ml (milieu minimum + casaminoacides + glucose) je mets 160 µl de Cm à 50 mg/ml.

Si ta souche n'exprime pas une cat, ca s'explique facilement par le stress cause par ton Cm. Tu ajoutes un antibiotique pour lequel ta souche ne semble pas etre resistante (d'ailleurs si c'est pas pour conserver un plasmide, interroge toi sur le pourquoi de cette selection...), il va donc y avoir pleins de reponses dans la cellule, certaines peuvent effecter ton ADN plasmidique.

A+

Ce qu'on m'a vaguement expliqué quand j'ai demandé le pourquoi de l'ajout du Cm (parce que ça m'a semblé bizarre d'en ajouter), c'est qu'il y aurait un effet positif sur la production de l'ADN plasmidique (ne me demande pas pourquoi, je n'ai rien compris à cette histoire de toute façon ).

Du coup, je ne comprends toujours pas pourquoi ajouter cet antibio alors que ce n'est pas lui qui sert à garder le plasmide


Cordialement,

[gorben]

lol Malicia, c'est enorme cette quantite de Cm !!!!!!
Ca te fait du 200 ug/ml, generalement on utilise 10 a 20 ug/ml pour maintenir un plasmide.

Si tu ajoutes du Cm ici c'est pour augmenter le nombre de copie du plasmide. J'imagine que tu dois l'ajouter quand tes cellules sont a DO 0.6-1.0? En fait le Cm va inhiber la traduction, du coup les cellules vont arreter de pousser, mais la replication de l'ADN va continuer. Ta DO va donc etre stable, mais la quantite d'ADN et donc de plasmide va augmenter. Du coup tu vas recuperer plus de plasmide tout en utilisant un kit pour une miniprep.
Il me semble que ca ne marche que sur les origines colE1 (a verifier)

A+

Edit : J'ajouterai que c'est une manip un peu "ancienne", et que souvent l'ADN est de mauvaise qualite... generalement on fait ca pour economiser un peu d'argent en faisant une miniprep au lieu d'une maxi prep. Si c'est l'argent ton probleme, tu peux faire une extraction phenol/chloroforme (jusqua la precipitation), puis echainer avec une miniprep pour bien purifier ton ADN.

[invite17a570c1]

lol Malicia, c'est enorme cette quantite de Cm !!!!!!
Ca te fait du 200 ug/ml, generalement on utilise 10 a 20 ug/ml pour maintenir un plasmide.

Euh j'ai encore laissé mon cerveau partir en vacances sans moi... C'est 160 µl à 5 mg/ml... pas à 50 (c'est mon stock de Kana qui est à 50mg/ml, du coup, j'ai confondu). Sinon, oui, à 50 c'est énorme

Si tu ajoutes du Cm ici c'est pour augmenter le nombre de copie du plasmide. J'imagine que tu dois l'ajouter quand tes cellules sont a DO 0.6-1.0?

Même carrément avant : je prends des précultures avec lesquelles j'ensemence mes milieux minimum pour que la DO final soit à 0.2, puis je laisse incuber jusqu'à DO ~ 1.5 et je commence l'extraction.

En fait le Cm va inhiber la traduction, du coup les cellules vont arreter de pousser, mais la replication de l'ADN va continuer. Ta DO va donc etre stable, mais la quantite d'ADN et donc de plasmide va augmenter. Du coup tu vas recuperer plus de plasmide tout en utilisant un kit pour une miniprep.
Il me semble que ca ne marche que sur les origines colE1 (a verifier)

Ah ok! Dis ainsi, c'est compréhensible Merci.

Edit : J'ajouterai que c'est une manip un peu "ancienne", et que souvent l'ADN est de mauvaise qualite... generalement on fait ca pour economiser un peu d'argent en faisant une miniprep au lieu d'une maxi prep. Si c'est l'argent ton probleme, tu peux faire une extraction phenol/chloroforme (jusqua la precipitation), puis echainer avec une miniprep pour bien purifier ton ADN.

Non, je ne crois pas que ce soit un souci d'argent si important, en fait. Disons qu'ils ont leurs habitudes et y tiennent


Merci encore, en tout cas!


Cordialement,

[gorben]

Même carrément avant : je prends des précultures avec lesquelles j'ensemence mes milieux minimum pour que la DO final soit à 0.2, puis je laisse incuber jusqu'à DO ~ 1.5 et je commence l'extraction.

Bizarre, le principe du Cm est que tu inhibes la croissance pour amplifier le plasmide... ca ne tiens pas dans ton cas...

Tu devrais redemander et nous tenir au courant

A+

[invite17a570c1]

Bizarre, le principe du Cm est que tu inhibes la croissance pour amplifier le plasmide... ca ne tiens pas dans ton cas...

Ouaip... Je vais en faire 2 en parallèle : l'une en ajoutant le Cm dans la préculture, l'autre en gardant le protocole actuel.

Tu devrais redemander et nous tenir au courant

A+

Oki doki une fois que j'aurais fini le p***** de rapport de stage...


Cordialement,

[invite17a570c1]

Hello,

Tu devrais redemander et nous tenir au courant

A+

Donc, les nouvelles, comme promis
Cm ajouté dans la préculture comme tu m'as conseillé, Gorben, à DO = 1 et à DO = 1.5, puis j'ai laissé la nuit à 37°C avec agitation. Le matin extraction selon le protocole QIAgen, avec des volumes de culture différents : 20 ml et 10 ml, de chaque condition physiologique. C'était moins sale lorsque je récupérais les cellules auxquelles j'ajoutais le Cm à DO = 1 et dont je prenais 10 ml; mais ça ne me satisfaisais toujours pas...
Donc, j'ai retransformé... des DH5 alpha. Et, ô surprise qui n'en est pas une, à DO = 1 et à DO = 1.5 avec 10 ml de cellules, les ADN nickel J'avais complètement éclipsé d'aller chercher du côté nucléases dans cette foutue MC4100. Beh après vérification, elle en est bourrée. Du coup, avec DH5 alpha, c'est super propre, j'ai eu les résultats du séquençage et tous mes clones sont parfaits (sauf un qui a une mutation ponctuelle dans le tag His ), donc, j'ai débuté les expressions en milieu autoinducteur

C'est un bon retour au labo après les examens, ça


Merci encore une fois pour les conseils, je ne promets pas de ne pas en redemander


Cordialement,