Répondre à la discussion
Page 1 sur 2 1 DernièreDernière
Affichage des résultats 1 à 30 sur 31

Problème de culture de bactéries



  1. #1
    dankiller

    Unhappy Problème de culture de bactéries


    ------

    Bonjour;
    Voila je suis actuellement un stage dans un laboratoire de biologie du dévellopement. Je cherche a séquencer Par PCR dégénerée un fragment de gène. Nous utilisons nos amorce 5' et nos amorces 3' etc... vérification sur gel d'Agarose 1% avec BET tout va bien on a deux réponse positive dont une migration assez importante et intressante.

    On se propose donc de cloner en vue d'un séquençage ces deux fragments.
    On effectue donc une ligation avec PGEMT easy,tout ca se passe bien.La on effectue une transformation par éléctroporation sur XL1 bleu.Puis ont met en culture.
    Pour l'histoire on a fait 2 ligations, 5 mise en cultures par plusieurs personnes différentes mais a aucun moment on a de culture qui poussent.

    J'ai pensé au fait que le fragment que l'on a amplifier devait débuter en un don similaire a un pathogène pour les bacteries,seulement,on a effectuer ceci sur 2 fragment de 1,5kb et 1,2kb (je crois faudrez que je verifie).Mais toujours aucune colonie exploitable pour la miniprep.

    Donc voila, on peut écarter les erreurs de manip ou de materiel vu que plusieurs clonage ont été effectué en même temps et que ceux ci donnent des colonies tout a fait exploitable.

    Pour info la mise en culture s'effectue avec un mix 50µL de XL1 blue,1µL de ligation.Sur un milieu LB ampiciline avec 30µL de XGAL et 50µL d'IPTG.

    Quelqu'un aurais une idées du pourquoi ceci ne fonctionne pas?Et aussique faire alors dans ce cas?

    Pour info je suis en L1 donc n'essayer pas trop de charabia même si je comprend tout ce que j'ai lu sur le forum.

    -----

  2. Publicité
  3. #2
    jmbowie

    Re : Probleme de culture bacteries

    Citation Envoyé par dankiller Voir le message
    - PCR dégénerée
    - on a deux réponses positives

    On se propose donc de cloner en vue d'un séquençage ces deux fragments.
    On effectue donc une ligation avec PGEMT easy,tout ca se passe bien.La on effectue une transformation par éléctroporation sur XL1 bleu.Puis ont met en culture.
    Pour l'histoire on a fait 2 ligations, 5 mise en cultures par plusieurs personnes différentes mais a aucun moment on a de culture qui poussent.

    J'ai pensé au fait que le fragment que l'on a amplifier devait débuter en un don similaire a un pathogène pour les bacteries,seulement,on a effectuer ceci sur 2 fragment de 1,5kb et 1,2kb (je crois faudrez que je verifie).Mais toujours aucune colonie exploitable pour la miniprep.

    Donc voila, on peut écarter les erreurs de manip ou de materiel vu que plusieurs clonage ont été effectué en même temps et que ceux ci donnent des colonies tout a fait exploitable.

    Pour info la mise en culture s'effectue avec un mix 50µL de XL1 blue,1µL de ligation.Sur un milieu LB ampiciline avec 30µL de XGAL et 50µL d'IPTG.

    Quelqu'un aurais une idées du pourquoi ceci ne fonctionne pas?Et aussique faire alors dans ce cas?

    Pour info je suis en L1 donc n'essayer pas trop de charabia même si je comprend tout ce que j'ai lu sur le forum.
    - Tu peux écarter l'hypothèse de l'insert pathogène, car les cellules transformées par des vecteurs ne l'ayant pas inséré (il y en a surement) auraient poussée
    - Qu'entend-tu par deux réponses positives? 2 produits de PCR?
    - As-tu de bonnes constantes de temps en électroporation? En principe oui, sinon il y aurait des arc électriques et tu serais au courant
    - Quel est la concentration de ton antibio? l'ampi s'utilise en général ) 100microgram/ml final, le Xgal à 40microgramme/ml final et l'IPTG à 1mM final.
    - D'autre part, je viens de voir que c'est un vecteur qui est linéaire. Avec quel polymérase amplifie tu ton insert? Tu peux essayer, pour augmenter le rendement de ton clonage, de faire un petit traitement à la Taq en plus, pour qu'elle rajoute des "A" à la fin de tes inserts s'il n'y en a pas, le protocole est dans le manuel du Kit pGEmT
    Bon courage
    Blast up your life!

  4. #3
    remorhaz

    Re : Probleme de culture bacteries

    Effectivement qu'est ce que c'est 2 réponses positives ? Ce sont deux bandes que tu découpes et purifies puis que tu utilises pour faire 2 ligations ?

    C'est peut être les ligations qui foirent, tu pourrais mettre plus de produit de PCR dans ta ligation ? Laisser liger plus longtemps et mettre plus de produit de ligation dans tes XL ?

    Remo

  5. #4
    piwi

    Re : Probleme de culture bacteries

    Il y aussi la bête hypothèse que les bactéries ne soient simplement pas compétantes... Du coup rien ne rentre, rien ne pousse.
    Vous avez une controle positif de transformation avec ces bactéries? (type pSK+ tout bête)

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  6. #5
    dankiller

    Re : Probleme de culture bacteries

    Alors nos réponses positive correspondent a la migration de notre produit PCR sur gel d'Agarose et BET.On a deux couple d'amorce qui ont fonctionné et bien amplifié.

    Pour le rajout de AAA ca a été fait sur les produits PCR et ça n'a rienf ait.

    Non on utilise 2µL pour la migration sur gel de notre produit PCR puis on effectue directement la ligation.

    On a aussi fait varier de temps de ligation de 2h a 1nuits.

    On a amplifier notre insert avec Gotaq en effectuant un hot start (couvercle chauffant donc sans huile), mais le probleme ne semble pas venir de la PCR.Pour verifier on a effectuer plusieurs miation sur gel et rien ne semble avoir changé.

    Pour l'electroporation, les constante de temps sont parfaites, on a pas d'arc (ouf) et le dépot et la mise en culture conforme au temps du protocole fournis par le laboratoire.

    Lebacteries utilisés sont competente,mais pour des raisons diverses,hier on a effectué des culture sur TOP 10 avec transformation par choc thermique et ce matin,on a eu que des colonies bleues,les bacteries ne semblent pas avoir survecues et les seules survivantes n'ont pas integrer l'insert.

    Concernant la ligation on effectue ceci avec pour un VF de 10µL respectivement dans nos differents essais 1µL 2µL et 3,5µL.

    Pour la concentration en ampi la aussi aucun probleme les milieux de cultures sont préparé a l'avance et pris au hasard,de nombreuse culture identique ont été effectué et aucun probleme.

    Donc le probleme vient vraissemblablement pas du materiel,ni du protocole et pas de la manip car effectué par plusieurs personnes.


    Merci de votre aide en tout cas.

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    jmbowie

    Re : Probleme de culture bacteries

    Si tu veux, j'ai un protocole rapide pour fabriquer soit-même des compétentes pour électroporation, car tes stocks de compétentes sont peut-être nazes.

    Quelle est la souche que tu utilises? Essaie une autre au cas où genre des DH5alpha que tu rendrais compétentes toi même.

    Sinon c'est quoi ton insert? un gène entier?
    Blast up your life!

  9. Publicité
  10. #7
    dankiller

    Re : Probleme de culture de bactéries

    Nos bacteries semblent competente, et ceci n'explique pas non plus pourquoi avec des bacteries de commerce TOP10 la aussi ça na pas fonctionné.

    Notre irt PGEMTeasy de ce cote il ne semble n'y avoir aucun probleme,car de nombreuse culture ont ete mise en place avec le même insert.

    Apparement d'apres notre directeur de laboratoire il peut s'agit d'un probleme au niveau de la digestion et de l'insertion.On va utiliser donc un autre insert que PGEMTeasy car celui ci pourrais présenter plusieur site d'attirance avec notre gene.Cependant ca nous parrait mais alors la vraiment byzare.

    Pour info on est plus d'une dizaine dans le labo a se casser la tête alos si un forum peut nous aider

  11. #8
    piwi

    Re : Probleme de culture de bactéries

    Juste une question, comment verifiez vous que vos bactéries blanches n'ont pas d'insert?
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  12. #9
    jmbowie

    Re : Probleme de culture de bactéries

    EN PCR colonies je suppose non?

    Essaie un autre vecteur pour le clonage peut-être, avec le vecteur TOPO plutôt que pGEmt-easy. Ou bien en amplifiant avec des amorces ayant des sites de restrictions puis clonage dans un vecteur adapté à ce que tu veux faire de tes inserts.
    Blast up your life!

  13. #10
    dankiller

    Re : Probleme de culture de bactéries

    Oui on va tenter un autre vecteur.Sinon j'avez pensé a tenter une précipitation de la PCR avec de l'ethanol 70% et des cristaux pour ensuite relancer de façon classique la tranfo.Merci c vos idées en tout cas je vous tient au courant.

  14. #11
    dankiller

    Re : Probleme de culture de bactéries

    Apres avoir fait la même experience avec 3 autres vecteur,apres avoir effectuer une précipitation...Aucune culture donc voila,nous avons epuisez nos hypothese d'erreurs,on va donc recommander des amorces extrémements cheres a nouveau OUIN OUIN.

  15. #12
    schkougn

    Re : Problème de culture de bactéries

    tu pourais essayer de reprendre tes bactéries dans un milieu différant que du LB (SOC,..) ou les laisser un peut plus longtemps récupérer après l'electroporation dans ton milieu sans marqueur de sélection 1h au lieu de 30minutes au risque de perdre des plasmide.

  16. Publicité
  17. #13
    jmbowie

    Re : Problème de culture de bactéries

    Citation Envoyé par schkougn Voir le message
    tu pourais essayer de reprendre tes bactéries dans un milieu différant que du LB (SOC,..) ou les laisser un peut plus longtemps récupérer après l'electroporation dans ton milieu sans marqueur de sélection 1h au lieu de 30minutes au risque de perdre des plasmide.
    Sachant qu'en général on fait plutôt 1h.
    Blast up your life!

  18. #14
    jmbowie

    Re : Problème de culture de bactéries

    Es-tu sûr de la viabilité de tes cellules compétentes? (même sans marqueur)
    Blast up your life!

  19. #15
    Mybio

    Re : Probleme de culture bacteries

    Citation Envoyé par dankiller Voir le message
    Alors nos réponses positive correspondent a la migration de notre produit PCR sur gel d'Agarose et BET.On a deux couple d'amorce qui ont fonctionné et bien amplifié.

    Pour le rajout de AAA ca a été fait sur les produits PCR et ça n'a rienf ait.

    Non on utilise 2µL pour la migration sur gel de notre produit PCR puis on effectue directement la ligation.

    On a aussi fait varier de temps de ligation de 2h a 1nuits.

    On a amplifier notre insert avec Gotaq en effectuant un hot start (couvercle chauffant donc sans huile), mais le probleme ne semble pas venir de la PCR.Pour verifier on a effectuer plusieurs miation sur gel et rien ne semble avoir changé.

    Pour l'electroporation, les constante de temps sont parfaites, on a pas d'arc (ouf) et le dépot et la mise en culture conforme au temps du protocole fournis par le laboratoire.

    Lebacteries utilisés sont competente,mais pour des raisons diverses,hier on a effectué des culture sur TOP 10 avec transformation par choc thermique et ce matin,on a eu que des colonies bleues,les bacteries ne semblent pas avoir survecues et les seules survivantes n'ont pas integrer l'insert.

    Concernant la ligation on effectue ceci avec pour un VF de 10µL respectivement dans nos differents essais 1µL 2µL et 3,5µL.

    Pour la concentration en ampi la aussi aucun probleme les milieux de cultures sont préparé a l'avance et pris au hasard,de nombreuse culture identique ont été effectué et aucun probleme.

    Donc le probleme vient vraissemblablement pas du materiel,ni du protocole et pas de la manip car effectué par plusieurs personnes.


    Merci de votre aide en tout cas.

    Je ne sais pas comment on peut etre aussi dogmatique en écartant toutes les hypothèses susceptibles d'etre la cause !
    à mon avis, il faut partir dès le début et tout inspecter :
    - comme on l'a signalié ailleurs, tes bactéries peuvent etre tout simplement "incompétentes"! si elless sont congélées depuis des années, la compétence est nulle ou presque.
    - en utilisant l'électroporation, est-ce que tu précipite ta ligation pour éliminer toutes traces de sels qui pourrait réduire l'efficacité de transfo ?
    - normalement, il y a une proportion entre "insert/plasmide" à respecter selon leur tailles respectives. quelles tailles font tes insert et ton plasmide ?
    - Juste après l'électroporation, quand tu fais pousser tes bactéries électrochoquées dans de milieu LB pendant 1h, est-ce que ce milieu contient d'antibiotique? normalement, à cette étape le LB ne devrait pas contenir d'antiobiotique ! Donc s'il y a en a, il y a une très faible chance que les bactérie poussent.

  20. #16
    jmbowie

    Re : Probleme de culture bacteries

    Citation Envoyé par Mybio Voir le message
    Je ne sais pas comment on peut etre aussi dogmatique en écartant toutes les hypothèses susceptibles d'etre la cause !
    à mon avis, il faut partir dès le début et tout inspecter :
    - comme on l'a signalié ailleurs, tes bactéries peuvent etre tout simplement "incompétentes"! si elless sont congélées depuis des années, la compétence est nulle ou presque.
    - en utilisant l'électroporation, est-ce que tu précipite ta ligation pour éliminer toutes traces de sels qui pourrait réduire l'efficacité de transfo ?
    - normalement, il y a une proportion entre "insert/plasmide" à respecter selon leur tailles respectives. quelles tailles font tes insert et ton plasmide ?
    - Juste après l'électroporation, quand tu fais pousser tes bactéries électrochoquées dans de milieu LB pendant 1h, est-ce que ce milieu contient d'antibiotique? normalement, à cette étape le LB ne devrait pas contenir d'antiobiotique ! Donc s'il y a en a, il y a une très faible chance que les bactérie poussent.
    - S'il y avait du sel, il devrait y avoir un arc non?
    - Même si la ligation n'est pas dans les conditions optimales, c'est bizarre qu'il n'y ait aucun transformants. Peut-être faudrait-il étaler toutes les bactéries plutôt qu'un aliquot.
    - Il faudrait essayer des compétentes fraîches.
    Blast up your life!

  21. #17
    dankiller

    Re : Problème de culture de bactéries

    Merci pour la critique dogmatique.Mais bonj'ai prévenu que je n'etait qu'en premiere années,je fais un stage qui n'est pas obligatoire,donc je vous prie d'être un peu patient.

    Ensuite je veux bien que tu t'excite comme cela,mais j'ai déjà repondu a toutes t'est question.
    Le protocole,les bacteries etc... ne posent aucun probleme puisqu'elles sont utiisé des Dizaine de fois par jours dans le même labo.

    Donc je récapepette:
    Mon produit PCR a été verifié sur gel d'agarose 1% pour voir si on avez amplifier notre signal,le gel a finalement a 4 reprise confirmez que l'insert que l'on souhaité a été amplifié.
    -La ligation a été effectué avec PGEMT easy
    -On a utilisé 2 types de bacteries donc pas de chance de pathogene ni de bacteries incompetente.
    -On a effectué deux types de transfo par electroporation et par choc thermique.Avec a chaque fois un repos de minimum 1h.
    -Puis les bacteries sont déposée sur Gel LB avec 30µL d'XGAL et 50µL d'IPTG.Comme l'indique le protocole (et ça marche depuis des années comme ça)
    -Puis on verifie nos bacteries en culture avec l'oeil si on a des bacteries blanches on les piques et on les plonge pendant 1nuit dans 5mL de LB.
    La on a jamais aucune colonies.On a aussi tenté de placé le milieu de cultures a temperature ambiante ou a 37°C sans aucun résultat.

    Ensuite non on effectue pas de précipitation lors de notre ligation pour eliminer les traces de sel d'ailleur je vois pas a quoi cela pourrais bien servir...Plus d'indications?

    Mon plasmide c'est XL1 bleu ou TOP10 (deux cas tester),mon insert fait exactement 1,219pdb.

    Lors de l'electroporation on laisse 1h les bacteries a repossé dans un milieu LB sans ampi.

  22. #18
    MaliciaR

    Re : Problème de culture de bactéries

    Salut, Dankiller,

    Je te conseillerais de faire une précipitation de tes ligations quand même, c'est mieux pour l'électroporation.

    Sinon, quelles sont les proportions respectives insert : vecteur pour la ligation? Quel volume de ta ligation utilises-tu pour quel volume de cellules compétentes lors de la transformation? Es-tu sûr de bien ajouter le 1 mL de LB tout de suite après le choc électrique?

    Autre question : après avoir laissé exprimer 50 min ou 1h, que fais-tu pour étaler? Ce que je fais c'est 3 boîtes de chaque ligation :
    * l'une avec 10 uL de culture de transformants + 90 uL de LB, puis j'étale au rateau;
    * l'autre avec 100 uL de culture de transformants et étalement;
    * je centrifuge, j'enlève environ 900 uL du surnageant, je re-suspends le culot dans le peu de surnageant qui reste et j'étale.

    De cette manière, tu observes des choses précises...


    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  23. Publicité
  24. #19
    piwi

    Re : Problème de culture de bactéries

    Ya quand même deux points qui me chagrinnent.
    En général dans un crible blanc/bleu on a des faux positifs (colonies blanches sans insert). Tu dis n'en avoir jamais observé. C'est presque anormal ou alors vous avez vraiment du bol. D'ailleurs, as tu beaucoup de colonnies sur tes boites?

    Sinon à aucun moment vous (j'entends par là toi et ton équipe) ne remettez en question le fait que la ligation ne se fasse pas. Encore une fois, pas de bras, pas de chocolat! Vous pourriez tenter une ligation et faire migrer le produit à coté d'un plasmide vide. Ca vous assurerez que vous ne cherchez pas en vain ce qui n'exsite pas.

    En réflechissant un peu je me demande si la solution du problème ne viendrait pas de la Taq. Tu utilises la gotaq de chez proméga c'est cela? Il me semble qu'elle a une activité de proofreading. Est ce qu'elle ne virerait pas les A à la fin des fragments de PCR? Du coup ca peut pas liguer et c'est foutu, aucun clone. Vous avez essayé de changer de Taq?

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  25. #20
    dankiller

    Re : Problème de culture de bactéries

    Alors j'utilise 1µL de ma ligation pour 50µL de bacteries.Lors de l'elecroporation,j'ajoute 500µL de LB.Pour etaler les bacteries, on a utiliser deux systeme,l'un avec 1/10 et l'autre 9/10 ce qui ne donnez pas de resultat.
    Et la deuxieme technique c'etait pour un volume fnal de 550µL effectuer une culture a 50µL puis 100µL et le reste.La encore pas de resultat.
    J'etale avec des rateau fabriqué avec pipette en verre sous bec benzen séparé entre les differents elements.

    Ensuite on a remis en cause la ligation des le début,puisque on a effectué sur 2 produits PCR respectivement 2 ligation et 3 ligation.

    Pour la TAQ on s'est posez la question,mais le probleme ne semble pas venir de la car on a utiliser un produit PCR avec rajout de AAA avec la taq pol. ce qui a donc au pire rajouter les A et la aucun resultat aussi?

    Pour le crible blanc bleu, ont aurez aimé avoir ne serais ce que des colonie bleues,mais non, on a réelemet aucune colonie blanche bleu verte etc... rien du tout.En fait nos colonie ne poussent pas du tout.

  26. #21
    MaliciaR

    Re : Problème de culture de bactéries

    Euh... 1uL de ligation c'est vraiment peu... Je mets 10 uL (tout le monde au labo fait pareil, d'ailleurs). Sinon, j'ai déjà essayé avec 5 uL et c'est limite...
    Donc, première chose : refais ta transformation avec un volume plus grand de ligation. 1 uL est utilisé quand tu as de l'ADN de prep.

    Ensuite, as-tu fait des contrôles? J'entends par là : as-tu électroporé ton plasmide tout seul que tu étales ensuite? C'est un témoin indispensable Puis, as-tu pensé à étaler tes ligations sur des boîtes sans antibio? Qui sait, peut-être qu'il y a un problème d'expression de la résistance et tu te retrouves avec des sensibles donc aucune colonie...


    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  27. #22
    dankiller

    Re : Problème de culture de bactéries

    Okai je vais tenter d'augmenter ma concentration.

    Pour le plaside seul non.Mais je pense que mon labo a du le fe.

    Pour le fait d'etaler sans antibio ca a été fait et les bacteries n'ont pas poussées.

  28. #23
    jmbowie

    Re : Problème de culture de bactéries

    Citation Envoyé par dankiller Voir le message
    Okai je vais tenter d'augmenter ma concentration.

    Pour le plaside seul non.Mais je pense que mon labo a du le fe.

    Pour le fait d'etaler sans antibio ca a été fait et les bacteries n'ont pas poussées.
    Donc le souci vient de tes cellules alors! Pourquoi ne pas chercher à rendre vos cellules compétentes autrement. Comment les rendez-vous électrocompétentes?
    Blast up your life!

  29. #24
    Mybio

    Re : Problème de culture de bactéries

    Bis... 1µl de ligation me parait très peu ! le minimum qu'on utilise d'habitude est de 5µl et mieux 10µl comme l'a dit Malicia.

    Par ailleurs, est-ce que tu as des colonies blues (théoriquement non transformées)?
    Si tu n'as pas de colonies du tout, même pas de blues (non transformées) ça veut dire que le problème est là. Il faut alors utiliser des bactéries "fraîchement compétentes" !

    Sinon, le problème peut venir aussi des produits PCR et leur pureté. S'ils sont mélangés avec d'autres sels, ça peut être la cause. Exposes-tu le gel longtemps aux UVs (utilises-tu ce gel ensuite pour la purification de tes produits pour la ligation ?

    si tu postes un image de ton gel, ça pourrait éclaircir mieux les profiles de tes amplification !

    Si tu ne veux pas faire de grosses modifications parmi toutes celles qu'on t'a dites, à ta place j'essayerai au moins:
    - d'augmenter le volume de ligation rajouté à la bactérie (par exemple 10µl).
    - augmenter le volume (concentration) de tes produits PCR à liguer (mélangés avec le plasmide).
    - augmenter un peu le volume de ton enzyme ligase !

    Bonne chance

  30. Publicité
  31. #25
    dankiller

    Re : Problème de culture de bactéries

    Oui je vais tenter d'augmenter.

    Comme je l'ai dite de nombreuse PCR sont faites tous les jours avec ces bacteries donc si elles avaient un probleme il serait generalisé.Ensuitenon je n'ai strictement aucune bacteries quand je dépose mes bacteries ligué.Par contre si je les depose directement oui,elle marchent.

  32. #26
    Mybio

    Re : Problème de culture de bactéries

    Attends, vous utilisez les mêmes bactéries et elles poussent chez certains mais pas chez toi en utilisant excatement les mêmes procédures ?
    Si oui, le problème est alors technique, de manipulation, des mélanges...etc.!
    S'il est possible dans ton environnement, et sans vouloir te sousestimer, demande à une autre personne au labo de faire la manip une fois et comparez vos procédures, vos résultats !
    L'éléctroporateur fonctionne-t-il bien ? Sa puissance est adaptée à ne pas tuer les bactéries ?

  33. #27
    MaliciaR

    Re : Problème de culture de bactéries

    Je suis d'avis qu'il faut absolument que tu fasses 2 types de contrôles :
    * les bactéries électrocompétentes que tu électropores (tu suis le protocole de transfo avec la ligation mais tu n'ajoutes rien), puis tu étales sur tes boîtes sélectives et sur des boîtes où les bactéries devraient pousser (boîtes permissives). C'est un contrôle pour connaître la qualité de tes cellules : si elles ne poussent pas sur la boîte permissive c'est qu'il y a un souci...
    * tu transformes tes bactéries compétentes avec le vecteur seul et tu étales sur la boîte sélective. Comment faire : tu digères ton plasmide comme si tu allais faire une ligation, mais à la place des inserts, tu ajoutes du tampon (même volume que le volume des inserts) et tu fais une ligation dans les mêmes conditions que celles de ton plasmide + insert. Logiquement, tu auras un vecteur religué sur lui-même, donc un ADN double-brin circulaire qui a un pouvoir transformant. Ce contrôle te permet de savoir quelle tête auront les faux positifs, càd ceux qui auront intégré un plasmide sans insert.
    * je sais que je suis parano, donc ce contrôle est un peu facultatif : je transforme aussi avec les produits de PCR ayant suivi le même protocole de ligation que le reste... Normalement, c'est de l'ADN double-brin linéaire ne portant ni origine de réplication, ni gène de résistance à l'antibiotique de sélection. Je ne m'attends pas à avoir des colonies dans ce cas. Si j'en ai, cela signifierait que j'ai eu une contamination. C'est un contrôle à faire si tu veux vraiment vraiment exclure toutes les possibilités.

    C'est à ce moment que tu auras des résultats exploitables et interprétables. Sans contrôles, tu ne peux pas conclure grand-chose...

    Enfin, je n'ai toujours pas eu ma petite réponse : quelles sont les proportions de plasmide et d'insert que tu mets dans ta ligation? C'est important, le rapport 3 (insert):1 (plasmide) est plutôt optimal. (J'ai trouvé un vieux papier des années 1980 qui établit ce rapport pour la première fois, c'est tout un machin pas possible avec des cinétiques de réaction intra- et intermoléculaires... )


    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  34. #28
    dankiller

    Re : Problème de culture de bactéries

    Alors oui on a déja effectué avec autres personnes des post doc etc... et toujours le même resultat.

    Pour mon rapport ligation plasmide je l'ai monté a 10µL pour 50µL de bacteries hier et je n'ai la encore pas obtenue de colonie.

    Comme vous me l'avez demandé j'ai déposé des bacteries avec le tampon sur milieu LB ampi elle n'ont pas poussée et sur un milieu permissif la elles ont poussée.

    Ensuite j'ai demandé a un post doc si on pouvez verifier si le vecteur et l'insert sont bien penetrée dans les bacteries il ma dit qu'il allez le faire.J'attend le résultat pour ce soir.


    Sinon je comprend pas ce que tu veux dire par rapport entre plasmide et insert, peut tu m'expliquer stp?

    Apres oui je sais j'ai directement mis en cause une erreurde manip de ma part, mais le probleme vient du fait que la manip faite par d'autre personne ne fonctionne pas aussi.
    Donc d'apres mon maitre de stage,dans l'insert,on a peut être pris un site pathogène pour toutes bacteries ou nonigable.On attend nos nouvelle amorces.Je vous tient au courant.

  35. #29
    piwi

    Re : Problème de culture de bactéries

    Le rapport 3:1 n'est pas pertinent en soit. Ce qui est important c'est d'avoir un rapport equimolaire.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  36. #30
    MaliciaR

    Re : Problème de culture de bactéries

    Salut,

    Citation Envoyé par dankiller
    Sinon je comprend pas ce que tu veux dire par rapport entre plasmide et insert, peut tu m'expliquer stp?
    Il s'agit en fait de la quantité d'ADN de chaque partenaire de la réaction de ligation. Par exemple, une de mes ligations est du genre : un plasmide qui fait 5,4 kb, je choisis d'en mettre 60 ng; un insert qui fait 1,3 kb. Si je veux être en conditions 3(insert) : 1(plasmide), je mets 45 ng de l'ADN d'insert.

    Si tu n'as pas de colonies sur un milieu avec ampicilline, c'est que tes bactéries n'ont pas intégré de plasmide. As-tu fait des tranformations avec ces mêmes ligations mais avec d'autres bactéries hier? Et ce que tu peux faire, c'est essayer de transformer d'autres cellules avec tes ligations.
    Mais vu comment est parti ton truc, pourquoi s'obstiner à vouloir faire de l'électroporation alors qu'avec des thermocompétentes ça marche?


    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.

Sur le même thème :

Page 1 sur 2 1 DernièreDernière

Discussions similaires

  1. Réponses: 4
    Dernier message: 16/02/2012, 19h25
  2. [Microbiologie] Mise en culture de bactéries lactiques pour antibiogramme
    Par fibo81 dans le forum Biologie
    Réponses: 5
    Dernier message: 23/11/2007, 01h41
  3. TPE BACTéRIES -->bactéries dans l'alimentation --> yaourts
    Par joey1411 dans le forum TPE / TIPE et autres travaux
    Réponses: 18
    Dernier message: 25/10/2007, 15h32
  4. culture de bactéries
    Par cami dans le forum TPE / TIPE et autres travaux
    Réponses: 3
    Dernier message: 21/03/2007, 18h03
  5. culture de bactéries
    Par microoobe dans le forum TPE / TIPE et autres travaux
    Réponses: 0
    Dernier message: 30/01/2007, 21h15