RT-PCR semi-quantitative

[inviteb332a822]

Bonjour,

Je cherche une documentation ou un protocole claire et complet (y compris la normalisation) sur la RT6PCR semi quantitative.
Si quelqu'un aurait un tuyau, je serais très reconnaissant.


Merci et très bonne journée
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[invite186e1b0b]

Salut!

j'en ai fait énormément, quel est ton matériel de base ? tu pars avec quoi ? t'en es ou dans ta manip?

De mon coté: J'ai utilisé 2 réactions séparées:
une RT avec des amorces hexomériques sur les ARNm totaux me donnant une "banque" de cDNA et puis une bonne vieille PCR classique avec migration dans un gel d'agarrose 2% avec de l'EB. On digitalise tout cela et puis on quantifie..

si ca t'interresse ce genre de protocol, je te l'enverai

amicalement,

Greg

amicalement,

greg

[invite3e1bf8fd]

bonjour, membres biomolécularistes!

j'ai 2 questions:
1- dans une "reverse transcriptase-PCR", j'ai utilisé pour le même échantillon d'ARN, une amorce anti-sens dans un tube, et les 2 amorces (sens et anti-sens) dans un autre, sachant que mon ARN est transcrit avec l'amorce anti-sens, je dois avoir ma bande dans les 2 cas. Or, je n'ai eu de résultat qu'avec l'emploi d'une seule amorce, est ce que vous aurez une explication par hasard?? (sur le gel, je ne vois qu'un nuage de bandes du genre smear, pour l'échantillon avec 2 amorces)

2- est ce que vous aurez une méthode simple pour quantifier mon ADNc par spectrophotométrie?

merci d'avance, votre réponse me sera d'une grande utilité

amicalement

[gorben]

Bonjour,

Je cherche une documentation ou un protocole claire et complet (y compris la normalisation) sur la RT6PCR semi quantitative.
Si quelqu'un aurait un tuyau, je serais très reconnaissant.


Merci et très bonne journée

Salut,

C'est un abus de langage de dire "semi quantitative". On est quantitatif ou on ne l'est pas. Ce que tu veux c'est de la RTqPCR (Reverse Transcription quantitative PCR), a ne pas confondre avec la RTqrtPCR (Reverse Transcription quantitative real time PCR).
Pour qu'une PCR soit qantitative, il faut d'une que tu prouves avec un gene de menage que tu a la meme quantite d'ADNc au depart. Comme la PCR n'est pas toujours lineaire, il ne faut surtout pas quantifier en point final. Tu dois donc faire des PCR sur les echantillons purs, dilue 1/2, dilue 1/4, dilue 1/10, 1/20 etc etc...mais egalement avec des nombres de cycles differents, pour etre sur que tu te trouves bien dans la zone lineaire pour la quantification. De meme, si 20 cycles sont parfait pour quantifier ton gene d'interet, cela peut etre trop ou pas assez pour le gene de menage.
De meme si tu as une grosse difference d'expression de ton gene d'interet entre tes deux tubes, tu ne dois pas utiliser le meme nombre de cycle pour la PCR.

Si tu ne respectes pas ces conditions, la quantification n'est pas "semi", elle est juste fausse

Bref, contrairement a ce que l'on pourrait croire, le plus simple, le moins cher et le plus juste est de tres tres tres loin l'utilisation d'un thermocycler "real time".

A+

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteb332a822]

Salut!

j'en ai fait énormément, quel est ton matériel de base ? tu pars avec quoi ? t'en es ou dans ta manip?

De mon coté: J'ai utilisé 2 réactions séparées:
une RT avec des amorces hexomériques sur les ARNm totaux me donnant une "banque" de cDNA et puis une bonne vieille PCR classique avec migration dans un gel d'agarrose 2% avec de l'EB. On digitalise tout cela et puis on quantifie..

si ca t'interresse ce genre de protocol, je te l'enverai

amicalement,

Greg

amicalement,

greg

Oui ça m'intéresse en te remerciant par avance.
Je n'ai pas encore commencé mais c'est prévu pour la semaine prochaine, ce lundi !
Je vais utiliser un matériel végétal pour extraire les RNA totaux et synthétiser les cDNA à l'aide des oligo dT dans une réaction RT classique.
Mais le problème c'est que je ne sais pas comment faire pour en déduire que le gène d'intéret a été bien induit ou différentiellement induit en comparant deux conditions. Autrement dit, comment procédons une fois qu'on a les cDNA ?
On a synthétiser les cDNA des deux échantillons (2 conditions), faire une PCR, quantifier les signaux, faire un rapport stress/témoin par exemple ?
Comment normaliser les signaux dans RTPCR semi quantitative ?

EN vous remerciant par avance
Cordialement

[invite186e1b0b]

Salut!

C'est un abus de langage de dire "semi quantitative".

Faux cher ami ! la semi semi-quantitative est simplement une méthode un peu à l'ancienne qui consiste à mesurer le signal sur ton gel (avec une révélation à L'EB).

Dans mon cas on a fait aussi plein de tests pour savoir où on en était dans la courbe et puis on a simplement quantifié après sur le gel. C'est la différence avec la real time RT-PCR ou quantitative RT-PCR, où la mesure de l'intensité d'un signal (dépendant de ta technique) se fait pendant la PCR et à chaques étapes!

Ok, je t'enverrai le protocole quand je le retrouverai (avant demain matin promis)

Si tu travailles sur des plantes différente de la plante native (mutation, maladie,..) tu compares le niveau de tes signaux par rapport à la forme native (wild type) et donc tu auras tes graphiques avec des pourcentages.

POur la normalisation, j'ai utilisé le niveau de la cyclophylin, mais ca je ne sais pas si c'est applicable chez les végétaux...

amicalement,

Greg

[piwi]

Vous êtes certains pour la définition de semi-quantitative?
Pour moi semi quantitative suggère que l'on quantifie par rapport à une référence dont on ne connait pas la quantité exact. On donne donc le résultat en fold d'induction

Cordialement,
piwi

[gorben]

Salut,

Faux cher ami ! la semi semi-quantitative est simplement une méthode un peu à l'ancienne qui consiste à mesurer le signal sur ton gel (avec une révélation à L'EB).

Malgres le fait que ca n'a absolument aucune importance, je me repete pour dire que dans un langage scientifique correct, la PCR "semi quantitative" n'existe pas ! Elle est quantitative ou elle ne l'est pas. J'ai bien compris qu'au final on quantifie sur gel, mais si tu respectes bien les conditions, tu peux tout a fait quantifier aussi bien qu'en real time.

Dans mon cas on a fait aussi plein de tests pour savoir où on en était dans la courbe et puis on a simplement quantifié après sur le gel. C'est la différence avec la real time RT-PCR ou quantitative RT-PCR, où la mesure de l'intensité d'un signal (dépendant de ta technique) se fait pendant la PCR et à chaques étapes!

Il n'y a AUCUNE difference entre ce que tu as fais et ce que le thermocycler fait... le real time thermocycler est juste beaucoup plus pratique, mais au final il quantifie ton produit en phase lineaire, tout comme toi.

Et surtout, ne pas croire que real time = quantification, c'est faux. Il y a de la real time qui ne quantifie pas (genre detection de microorganisme etc).

A+

[gorben]

Salut,

Vous êtes certains pour la définition de semi-quantitative?
Pour moi semi quantitative suggère que l'on quantifie par rapport à une référence dont on ne connait pas la quantité exact. On donne donc le résultat en fold d'induction

Cordialement,

Oui cette explication est nettement plus plausible. Sur gel tu ne peux bien evidemment pas faire de quantification absolue (enfin c'est possible, mais tres peu pratique), du coup ce n'est que de la quantification relative. L'equivalent en real time du DDC_t. Mais la quantification n'est pas "semi", elle est "relative"

A+