Meilleure technique d'extraction ?

[invite28e24fd5]

Bonjour à tous,

Je travaille sur du sang humain dont je dois extraire l'ADN génomique pour faire des puces.
Pour l'extraction nous utilisons un kit qui donne un bon rendement et de l'ADN assez propre, mais la nouvelle responsable du service nous le déconseille, en disant que l'extraction phénol-chlorophorme nous permettra une meilleure conservation de l'ADN...
Pourtant la conservation devrait à la limite dépendre de la solution avec laquelle on reprend l'ADN, mais pas de la technique, non ?
Ou alors c'est une question de sous ?
Est-ce que quelqu'un ayant déjà utilisé les 2 méthodes sur du sang (kit et phenol/chlo) pourrait me donner son avis ?

Merci d'avance !
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[invite17a570c1]

Salut,

Tu travailles sur du sang total? Ou tu as des échantillons déjà pré-traités? Comment fais-tu tes amplifications de l'ADN génomique? Et quel ADN génomique t'intéresse : celui du patient ou celui des pathogènes?

Perso, je faisais une extraction phénol-chlo après les étapes de déplétion (je travaillais sur du sang total) et puis, plusieurs amplification de génomes totaux de pathogènes avant d'hybrider sur la puce...


Cordialement,

[inviteb332a822]

Salut,

Tu travailles sur du sang total? Ou tu as des échantillons déjà pré-traités? Comment fais-tu tes amplifications de l'ADN génomique? Et quel ADN génomique t'intéresse : celui du patient ou celui des pathogènes?

Perso, je faisais une extraction phénol-chlo après les étapes de déplétion (je travaillais sur du sang total) et puis, plusieurs amplification de génomes totaux de pathogènes avant d'hybrider sur la puce...


Cordialement,

A propos, et désolé pour ma question qui est pas directement lié au topic mais je vais bienôt le lancer ladedans. Quel type de puce utilisez-vous (c'est bien de puce à ADN) ?
Et quel protocole, logiciel de traitement de donnée utilisez vous, ou conseillez vous ?

Merci

[invite17a570c1]

A propos, et désolé pour ma question qui est pas directement lié au topic mais je vais bienôt le lancer ladedans. Quel type de puce utilisez-vous (c'est bien de puce à ADN) ?
Et quel protocole, logiciel de traitement de donnée utilisez vous, ou conseillez vous ?

Merci

J'utilisais la puce GeneChip CustomID multipathogènes d'Affymetrix. Enfin, la 1re génération, pendant que j'étais là, on finissait la 2nde et on a commencé à la tester. C'est une puce de re-séquençage, pas d'expression.
Il te faut passer une formation, sinon tu auras du mal à suivre. De toute manière, les gens d'Affy France sont cool, si l'on vous accorde l'achat de la station et tout le tralala, ils s'occuperont à vous expliquer comment ça marche Les logiciels sont évidemment fournis avec, le pc, le scanner, tout.


Cordialement,

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite28e24fd5]

Salut,

Tu travailles sur du sang total? Ou tu as des échantillons déjà pré-traités? Comment fais-tu tes amplifications de l'ADN génomique? Et quel ADN génomique t'intéresse : celui du patient ou celui des pathogènes?

Perso, je faisais une extraction phénol-chlo après les étapes de déplétion (je travaillais sur du sang total) et puis, plusieurs amplification de génomes totaux de pathogènes avant d'hybrider sur la puce...


Cordialement,

Bonjour,

En fait je travaille sur sang total, à partir de prélèvement de patients en tubes héparine-lithium (on cherche à caractériser des gènes impliqués dans le retard psycho-moteur). A partir de ces échantillons, on utilise la technique de CGH-Array.
On voudrait développer l'analyse par QMPSF aussi, c'est peut-être à ce niveau que la technique d'extraction est critique ?
Est-ce que le fait de dépléter le sang est intéressant dans mon cas ? Et si oui comment tu fais ?

Merci pour ton aide

[inviteb332a822]

J'utilisais la puce GeneChip CustomID multipathogènes d'Affymetrix. Enfin, la 1re génération, pendant que j'étais là, on finissait la 2nde et on a commencé à la tester. C'est une puce de re-séquençage, pas d'expression.
Il te faut passer une formation, sinon tu auras du mal à suivre. De toute manière, les gens d'Affy France sont cool, si l'on vous accorde l'achat de la station et tout le tralala, ils s'occuperont à vous expliquer comment ça marche Les logiciels sont évidemment fournis avec, le pc, le scanner, tout.


Cordialement,

Merci MaliciaR
Je vais voir le genre de puce qu'on va utiliser !
Bonne journée

[invite17a570c1]

Salut,

Bonjour,

En fait je travaille sur sang total, à partir de prélèvement de patients en tubes héparine-lithium (on cherche à caractériser des gènes impliqués dans le retard psycho-moteur). A partir de ces échantillons, on utilise la technique de CGH-Array.

Ok, donc, tu t'intéresses uniquement au génome eucaryote que tu extraies.
Je ne connais pas les détails des conditions d'hybridation sur CGH. As-tu un seuil de quantité d'ADN pour pouvoir hybrider? Dans mon cas, je m'intéressais aux quelques minimes copies de génomes viraux que je pouvais chopper dans le sang total et donc, je devais avoir au minimum 10^7-8 copies de génomes viraux pour espérer détecter quoi que ce soit sur la puce... Donc, les WGA et les RT-qPCR en veux-tu, en voilà...

Est-ce que le fait de dépléter le sang est intéressant dans mon cas ? Et si oui comment tu fais ?

Merci pour ton aide

Ugh, tu me poses une question à laquelle je pourrai répondre quand j'aurais revu mes notes de l'an dernier J'avais un protocole longuet avec de la protéinase K, de l'EDTA, des détergents divers, en plus d'un kit de chez Roche, si je me souviens bien (MagnaPure, ou un truc ressemblant, avec des billes magnétiques ).
Je pense qu'il te faut débarasser ton échantillon de tout ce qui ne t'est pas nécessaire, oui.


Hope that helps


Cordialement,


P.S. Concernant l'extraction au phénol-chlo, je crois qu'on ajoutais aussi de l'alcool isoamylique.

[inviteecd0c83b]

bonjour, j'ai recueillis du sang total humain en présence d'EDTA, j'ai commis une faute en conservant ce sang à -80°C ce qui provoquera une hémolyse, est ce que je peux, comme même, extraire l'ADN à partir ce sang congelé????????? SVP il n'ya pas une solution?? j'ai besoin d'aide
merci d'avance

[Flyingbike]

aucun probleme a mon avis. Je connais des gens qui récupèrent de l'ADN de sang congelé. Je te propose de chercher des protocoles sur internet, il y a pas mal de solutions. Par exemple : http://www.protocol-online.org/prot/...ood/index.html

[invited17dbc2d]

Bonjour,

Je serais très intéréssée par ta méthode de déplétion des ADN génomique. J'ai besoin de cette technique afin de pouvoir faire du séquençage seulement sur des pathogénes sans avoir des séquences parasites ADN génomique

Merci pour ta réponse rapide.

nérubis