Contamination transformation

[invitea88510e3]

Bonjour,

Depuis peu j'ai des contaminations sur mes boites de gélose lors de mes transformations...
J'ai fais une transformation en bactéries Top10F' pour effectuer une recombinaison homologue entre un plasmide conférant une résistance ampicilline et un ADNg. A l'issu de la transformation de petites colonies sont apparues sur la gélose après 24h d'incubation...jusque là tout est normal.

Plusieurs problèmes se pose lors des miniprep:

- tout d'abord certaines colonies prennent une coloration vert-bleue lors de la mise en culture liquide....
- Lorsque je centrifuge les bactéries, le culot n'a pas un aspect normal et "blanc" comme il doit l'être habituellement avec des E.Coli.
- ensuite, lorsque je fais les miniprep, je ne récupère aucun ADN...quantification très faible et dépot sur gel négatif...

Il ne s'agit donc ni de mon plasmide recircularisé, ni de mon plasmide recombinant, ni d'un ADN plasmidique quelconque...

Est-ce que j'ai une contamination une bactérie quelconque résistante ampicilinne ? Comment ai-je pu contaminer...sachant que je travail sous une hotte, avec des gants et bien proprement ???? Apparement il ne s'agit ni des boites, ni du milieu de culture, ni du SOC....je ne comprend pas !!!!


Merci d'avance pour votre aide !!!
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[invitee863e61a]

Bonjour,

Depuis peu j'ai des contaminations sur mes boites de gélose lors de mes transformations...
J'ai fais une transformation en bactéries Top10F' pour effectuer une recombinaison homologue entre un plasmide conférant une résistance ampicilline et un ADNg. A l'issu de la transformation de petites colonies sont apparues sur la gélose après 24h d'incubation...jusque là tout est normal.

Plusieurs problèmes se pose lors des miniprep:

- tout d'abord certaines colonies prennent une coloration vert-bleue lors de la mise en culture liquide....
- Lorsque je centrifuge les bactéries, le culot n'a pas un aspect normal et "blanc" comme il doit l'être habituellement avec des E.Coli.
- ensuite, lorsque je fais les miniprep, je ne récupère aucun ADN...quantification très faible et dépot sur gel négatif...

Il ne s'agit donc ni de mon plasmide recircularisé, ni de mon plasmide recombinant, ni d'un ADN plasmidique quelconque...

Est-ce que j'ai une contamination une bactérie quelconque résistante ampicilinne ? Comment ai-je pu contaminer...sachant que je travail sous une hotte, avec des gants et bien proprement ???? Apparement il ne s'agit ni des boites, ni du milieu de culture, ni du SOC....je ne comprend pas !!!!


Merci d'avance pour votre aide !!!

Cas typique avec les transformants sur ampicilline: le gène de résistance à l'ampicilline qui est sur ton vecteur code une protéine qui peut diffuser dans le milieu et conférer une pseudo-résistance à des cellules qui n'ont pas ton plasmide, donc des faux-positifs: en général ces cellules sont plus petites et se trouvent autour des vrais positifs, ceux qui sont les vrais transformants: ce n'est donc pas forcément lié à une conta. Pour bien faire le distinguo:
- utilise une concentration d'ampi à au moins 100microG/ml final
- laisse pousser suffisamment longtemps pour discriminer les vraies transformants des faux-positifs. Tu peux aussi les repiquer sur Ampi pour vérifier leur phénotype ou faire une PCR colonies avec des amorces spécifiques de ton vecteur.
A plus

[invitea88510e3]

Non il ne s'agit pas de colonies satellites qui ont récupérer la résistance ampicilline...Elles n'en ont pas le profil et aucune de mes colonies n'est positive ni en screening PCR ni en miniprep.

Pour info, La petite taille des colonies est liée au fait que je cherche à obtenir un plasmide final de 30 kpb (plasmide intégrant le génome d'un virus)...ce qui limite leur croissance...

Donc je suis persuadée qu'il s'agit d'une contamination, d'autant plus que la coloration du milieu après mise en culture n'est vraiment pas normale....mais de quoi ????

[invite17a570c1]

Euh... Ce que je ne comprends pas c'est comment c'est possible qu'après une prep tu ne récupères aucun ADN... S'il y avait un contaminant, tu aurais récupéré son ADN plasmidique.
A ta place, je vérifierais mes solutions de preps. Il y a un gars du labo d'à côté qui s'était planté en faisant son EtOH 70% : il avait inversé les volumes d'eau et d'EtOH 100%... Du coup, il se retrouvait avec de l'EtOH 30% et il ne récupérait aucun ADN. Ou pareil dans les kits où il faut ajouter de l'EtOH 100% à la solution de lavage : si tu ne le fais pas, tu perds ton ADN...

Donc, regarde bien tes trucs : si tu avais des contaminants, tu aurais leur ADN. Sauf si tu as des contaminants ADN-free


Cordialement,


P.S. Comme tu m'as doublée : est-ce que tu ajoutes un colorant lors des preps (Qiagen a un kit de prep où on ajoute un colorant bleu)? Tu utilises quoi pour faire les preps d'ailleurs?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitea88510e3]

Je ne récupère aucun ADN plasmidique...il n'y a pas forcément d'ADN plasmidique dans des bactéries... Ce qui veut dire que ma contamination provient d'une bactérie résistante à l'antibiotique mais qui n'a pas intégrer un plasmide "parasite" issu du labo porteur de la résistance Ampi.

Ensuite pour le kit aucun problème car il est utilisé en routine par moi et d'autres personnes et rien à signaler. Il s'agit du kit nucléospin de Macherey-Nagel pour miniprep et il n'y pas de colorant utilisé. En revanche dans le kit MAxiprep de Qiagen il y a effectivement utilisation d'un colorant bleu au moment de la lyse bactérienne...

Si d'autres hypothèses, je suis prenneuse car à nouveau ce matin après avoir lancée des cultures sur la nuit je me retrouve avec le même problème de coloration vert-bleu....

[invitea88510e3]

une contamination à pseudomonas .... c possible ????

[invitee863e61a]

Je ne récupère aucun ADN plasmidique...il n'y a pas forcément d'ADN plasmidique dans des bactéries... Ce qui veut dire que ma contamination provient d'une bactérie résistante à l'antibiotique mais qui n'a pas intégrer un plasmide "parasite" issu du labo porteur de la résistance Ampi.

Ensuite pour le kit aucun problème car il est utilisé en routine par moi et d'autres personnes et rien à signaler. Il s'agit du kit nucléospin de Macherey-Nagel pour miniprep et il n'y pas de colorant utilisé. En revanche dans le kit MAxiprep de Qiagen il y a effectivement utilisation d'un colorant bleu au moment de la lyse bactérienne...

Si d'autres hypothèses, je suis prenneuse car à nouveau ce matin après avoir lancée des cultures sur la nuit je me retrouve avec le même problème de coloration vert-bleu....

Comme une colonie satellite alors. Sinon, tu peux regarder vers les espèces naturellement résistances à l'ampicillines comme les Klebsielles. D'autre part, il existe des gènes de résistances chromosomiques aux B-lactames.
Si tu as un doute, repart de E.coli propres

[Zellus]

Salut,

J'ai pas tout bien suivi je crois ...
Tu veux intégrer le gène de résistance à l'ampicilline à tes bactéries c'est ça ?
Est-ce qu'il est pas possible que tes bactéries l'aient bien intégré dans leur génome par recombinaison ? Si c'est le cas, elles n'ont plus besoin du plasmide donc elles l'ont peut-être détruit, et donc tu ne peux plus le détecter (si c'est le cas tu devrais essayer de le chercher directement dans le génome de la bactérie).
Et pour la coloration verte, peut-être que l'intégration a eu lieu dans un gène codant pour une protéine impliquée dans une voie du métabolisme. Si cette protéine n'est plus produite à cause de la recombinaison, elle ne peut plus faire son boulot et il y a peut-être accumulation d'un métabolite vert dans les bactéries (cette protéine est donc probablement non essentielle).
Voilà, tu voulais un autre avis, en voilà un .

Cordialement,
Zellus

[invitea88510e3]

non pas du tout...je ne veux pas intégrer le gène de résistance. En fait j'ai des bactéries résistantes à l'ampi qui poussent sur mes boites ainsi qu'en culture liquide et qui n'ont rien à voir avec mes plasmides ou d'autres plasmides manipulés au labo...
Il s'agit d'une contamination par une autre souche bactérienne que les E.Coli compétentes. Je penses de plus en plus qu'il s'agit de pseudomonas...il ne me reste plus qu'à faire un antibiogramme et à tout décontaminé à la javel (bain marie, hotte) pour essayer de me débarrasser de ça !!