Immunocyto - Comment améliorer la fixation ?

[invite0e9887ab]

Bonjour à tous,


J'ai un petit soucis avec mes immunocytos. Mes cellules ont tendance à se décoler au cours de la manip en dépis de tous mes efforts et de toute ma délicatesse pour appliquer les différentes solutions.
Savez-vous comment améliorer la fixation sans altérer la reconnaissance de l'anticorps ?

Je pensais allonger le temps de fixation ou la concentration de la solution de fixation mais j'ai peur que l'anticorps ne reconnaisse plus correctement ma protéine.

Actuellement, je fais une fixation de 30min avec du formaldéhyde 4%. Et les cellules que je cherche à fixer sont des P19 (EC).

Bon, je pourrais faire comme ça car l'objectif est uniquement de voir si ma construction s'exprime et non le nombre de cellules dans lesquelles elle s'exprime. Mais j'aimerais quand même améliorer la manip pour la suite.

Merci d'avance !


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[piwi]

eurk... Des P19!
Bon courage, ca ne tient pas ces cellules...
Tu travailles dans quoi? Sur des boites coatées ou dans des labteck? Personnellement j'ai essayé dans des labteck et ça ne ressemblait à rien. Peut être cela vaudrait-il le coup de coater en polylysine histoire de leur conférer une meilleure accroche.
Sinon ben c'est des P19, donc il n'y aura pas de miracles absolu à mon avis.

[invite0e9887ab]

eurk... Des P19!
Bon courage, ca ne tient pas ces cellules...
Tu travailles dans quoi? Sur des boites coatées ou dans des labteck? Personnellement j'ai essayé dans des labteck et ça ne ressemblait à rien. Peut être cela vaudrait-il le coup de coater en polylysine histoire de leur conférer une meilleure accroche.
Sinon ben c'est des P19, donc il n'y aura pas de miracles absolu à mon avis.

Ok je vois. C'est donc plus "normal" que je ne le croyais.
En fait, je croyais que c'était moi qui n'étais vraiment pas douée.

Sinon, je travaille dans quoi...hum, c'est pas que tu parles chinois mais c'est tout comme. Je ne vois pas trop ce que c'est des labteck, boites coatées en polylysine etc.

En fait, moi, je cultive mes cellules en plaque 24 puits sur des petites lamelles de verre. Une fois mes traitements terminés, je rince ces lamelles avec du PBS plusieures fois et je fixe avec du formaldéhyde. Là je suis toujours avec des petites lamelles dans mes puits. Ensuite, pour faire l'hybridation de l'anticorps, je dépose mes lamelles sur des petits capuchons. Au final, ca permet je pense d'utiliser moins d'anticorps mais surtout de les monter facilement sur lamelle.

[piwi]

j'ai un peu mangé l'orthographe des lab-tek.
Tiens voici une photo:
http://www.nuncbrand.com/getbinary.a...filesize=59099

En fait il s'agit de lame d'histologie en verre sur lesquelles est collé une structure en plastique délimitant des chambres de cultures carrées ou rondes. On cultive donc les cellules directement sur la lame. On fait son immunocyto et ensuite on retire la structure plastique et l'on monte sa lame que l'on peut directement regarder au microscope.
Ca revient un peu au même que les lamelles de verre.

Le problème du verre c'est que certaines cellules adhèrent mal dessus. Pour essayer de palier ce défaut on colle dessus des molécules qui vont "simuler" une matrice extra-cellulaire. On peut coller par exemple des collagènes, des fibronectines. Cependant aujourd'hui le plus courant est de couvrir la lamelle (on coat) avec des molécules de polylysine. Tu peux en trouver chez sigma
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/...il/SIGMA/P4707 (d'autres fournisseurs doivent en produire aussi!)

piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite0e9887ab]

j'ai un peu mangé l'orthographe des lab-tek.
Tiens voici une photo:
http://www.nuncbrand.com/getbinary.a...filesize=59099

En fait il s'agit de lame d'histologie en verre sur lesquelles est collé une structure en plastique délimitant des chambres de cultures carrées ou rondes. On cultive donc les cellules directement sur la lame. On fait son immunocyto et ensuite on retire la structure plastique et l'on monte sa lame que l'on peut directement regarder au microscope.
Ca revient un peu au même que les lamelles de verre.

Le problème du verre c'est que certaines cellules adhèrent mal dessus. Pour essayer de palier ce défaut on colle dessus des molécules qui vont "simuler" une matrice extra-cellulaire. On peut coller par exemple des collagènes, des fibronectines. Cependant aujourd'hui le plus courant est de couvrir la lamelle (on coat) avec des molécules de polylysine. Tu peux en trouver chez sigma
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/...il/SIGMA/P4707 (d'autres fournisseurs doivent en produire aussi!)

piwi

Ok mille fois merci pour ces infos.

Ca semble super pratique les lab-teks mais je pense que ca doit quand même être un peu du luxe par rapport à mes petites lamelles de verre qui fonctionne bien pour les autres cellules.

Ce que tu dis à propos des polylysines m'intéresse beaucoup. Je me demandais si cela pouvait être équivalent à la gelatine ? En temps normal lorsque je passe mes cellules en flasque, je les cultive sur gelatine pour favoriser leur adhérence. Je ne le fais pas lors des immuno car je redoute de ne pas pouvoir retirer mes petites lamelles de verre...et comme les cellules se portaient bien (enfin, jusqu'au moment où je les arrête), je n'ai pas changé ma technique.

[invite0e9887ab]

Hello !!

Bon ben juste pour vous tenir au courant. (pour piwi en particulier)

J'ai refait l'immuno la semaine dernière en mettant cette fois de la gelatine. Cela a super bien fonctionné ! Franchement, presque aucune cellule décolée. Un beau petit tapis. Et avec ça, j'avais bien prévu le nombre de cellules donc pas de gros paquets bizarres ^^

Par contre, le résultat de l'expression de mes constructions n'est pas super concluant.... mais bon, on peut pas tout avoir.

Je recommence cette semaine.


Merci encore et à bientôt !