Clone sans ADN

[inviteb8ebed82]

Bonjour à tous,

je tente de faire du clonage à partir de PCR. Je génère tout d'abord mon Méga Primer à l'aide d'un premier PCR. Je le fais migrer sur gel d'agarose pour vérification et je le purifie (environ 1000pb). Puis, je fais un deuxième PCR, avec le Méga Primer obtenu ainsi que mon amorce nécessaire. Je fais encore migrer le tout sur gel d'agarose et je purifie (3000 pb).

Ensuite, je fais une ligation, soit overnight à 16 degré ou encore 1 heure a température de la pièce. Puis, je fais une transformation (version longue). J'ai des clones sur mes géloses ainsi qu'un bon ratio par rapport à mes géloses contrôles, tout ce qui a de plus simple jusque là.


Lors de l'extraction d'ADN, (j'ai tenter le mini-prep maison et le kit mini-prep biobasic) je n'obiens aucun ADN lors de la migration sur gel d'agarose. J'ai répété l'expérience plusieurs fois, à partir du début, ma superviseur a testé également les clones et à chaque fois, il n'y a pas d'ADN.

C'est vraiment un mystère dans notre laboratoire, les clones pas d'ADN. Je devrais en avoir, au moins si mes clones seraient négatifs, j'aurais mon vecteur vide. Mais là je n'ai rien, nada.

Merci de me soumettre vos suggestions.
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[invitec9f0f895]

Salut

La solution la plus simple serait que tu as une bactérie contaminante. Donc celle qui pousse n'est pas ce que tu crois.
Tes controles de contamination sont bons?

YOyo

[invitee863e61a]

Bonjour, avec quelle souche, quel antibiotique (et à quelle concentration) et quel vecteur travaillez-vous?

Il s'agit des clones d'une même transfo?

[invite98839ab8]

Salut,

certaines souches possèdent des DNases et sont donc réservé à l'expression uniquement. Peu être est ce votre cas? En tout cas on a eu ce problème au labo...

bonne journée

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitee863e61a]

Salut,

certaines souches possèdent des DNases et sont donc réservé à l'expression uniquement. Peu être est ce votre cas? En tout cas on a eu ce problème au labo...

bonne journée

Avec quelles souches as-tu eu des problèmes? J'ai déjà cloné dans BL21 sans souci.

[inviteb8ebed82]

Je n'ai pas de contamination dans mes pétris, d'autres personnes les ont utilisés et tout et je travaille en milieu stérile. Je vois mal avoir contaminé mes échantillons une dizaine de fois de suite alors que ça n'est jamais arrivé.

Je clone dans des DH5 alpha, le vecteur utilisé est pcmv tag 2B. J'utilise de la Kanamycine.

Merci pour votre intérêt!

[piwi]

Je pose une question idiote histoire que la réponse soit bien certaine même si elle m'apparait évidente.

Vous avez fais une transformation des mêmes cellules avec un autre vecteur? Vous avez réussi à le récupérer avec le même protocole d'extraction et les mêmes solutions?

Cordialement,
piwi

[inviteb8ebed82]

oui, effectivement. Nous faisons tous nos clonage dans les bactéries E. Coli Dh5 alpha ou BL21. Ce vecteur a également déjà été utilisé dans d'autres clonages.

[invitee863e61a]

oui, effectivement. Nous faisons tous nos clonage dans les bactéries E. Coli Dh5 alpha ou BL21. Ce vecteur a également déjà été utilisé dans d'autres clonages.

Et votre extraction est au point? C'est un kit? Vous êtes sûr qu'il fonctionne encore?
Vous n'avez vraiment rien en plasmide ou un petit peu?

[invite5d3aeb49]

Bonjour,

Pourrais tu préciser toutes les étapes de ta manip (version détaillée)?
Quel gène cherche tu a faire rentrer?

[inviteb8ebed82]

Oui le kit que j'utilise fonctionne très bien pour d'autres extraction.

Les manipulations sont celles habituelles en ce qui concerne le prc, la purification. La ligation se fait 1 heure a température de la pièce ou overnight a 16 degré. Pour ce qui est de la transformation :

Ensuite, une transformation dans les bactéries de type DH5 alpha a été effectuée. Le produit de ligation à été ajouté aux bactéries et incuber 30 minutes sur glace. Ensuite, on place le tout à 42° C pendant une minute, puis 10 minutes de nouveau sur glace. Du milieu LB préchauffé à 37° C est par la suite ajouté et on place le tout à agiter à 37° C pour une heure. Après, une centrifugation à 7000 rpm pendant une minute est effectuée et le surnageant est décanté. On resuspend le culot dans le 100 µl restant et on l’étend sur une gélose nutritive contenant du milieu LB ainsi que l’antibiotique spectinomycine. Une incubation à 37° C overnight est ensuite nécessaire.

Je ne cherche pas a faire entrer un gène complet, c'est en fait une partie, HIP1R et HIP1.2 . J'ai réussi à faire 3 mutations pour ces gènes et maintenant j'ai besoin des fulllenght avec des mutations silencieuses.

Merci encore

[piwi]

Bonjour,
Vous sélectionnez avec de la kanamycine ou de la spectinomycine? La carte de chez stratagene (qui produit le plasmide que vous utilisez) indique qu'il y a dedans un gène de résistance neo/kana. On peut se demander si vos bactéries résistent à la spectinomycine. M'enfin plus haut vous indiquiez sélectionner à la kanamycine. J'imagine que si vous avez changé, vous aurez au moins essayé de l'utiliser ne serait ce qu'une fois histoire de voir si ca n'est pas mieux.
Reste que l'on a vite fait de se laissé avoir. C'est arrivé il n'y a pas si longtemps à notre ingénieur qui a pourtant de la bouteille. Une boite ampi prise à la va vite et vous n'avez aucun clone parce que vous n'aviez pas vérifié que le plasmide ne conférait pas d'AmpiR.

Cordialement,
piwi

[invitee863e61a]

Oui le kit que j'utilise fonctionne très bien pour d'autres extraction.

Les manipulations sont celles habituelles en ce qui concerne le prc, la purification. La ligation se fait 1 heure a température de la pièce ou overnight a 16 degré. Pour ce qui est de la transformation :

Ensuite, une transformation dans les bactéries de type DH5 alpha a été effectuée. Le produit de ligation à été ajouté aux bactéries et incuber 30 minutes sur glace. Ensuite, on place le tout à 42° C pendant une minute, puis 10 minutes de nouveau sur glace. Du milieu LB préchauffé à 37° C est par la suite ajouté et on place le tout à agiter à 37° C pour une heure. Après, une centrifugation à 7000 rpm pendant une minute est effectuée et le surnageant est décanté. On resuspend le culot dans le 100 µl restant et on l’étend sur une gélose nutritive contenant du milieu LB ainsi que l’antibiotique spectinomycine. Une incubation à 37° C overnight est ensuite nécessaire.

Je ne cherche pas a faire entrer un gène complet, c'est en fait une partie, HIP1R et HIP1.2 . J'ai réussi à faire 3 mutations pour ces gènes et maintenant j'ai besoin des fulllenght avec des mutations silencieuses.

Merci encore

Attention avec la spectinomycine, on peut obtenir assez vite des faux-positifs de transformations qui sont des clones ayant obtenu un phénotype de résistance par mutation chromosomique (dans ARN16S): la kana c'est bien mieux.