Calcul de rendement

[invite9c78a1ce]

Bonjour. Voilà en ce moment je réalise des TP de biomoléculaire. On me demande de réaliser un calcul de rendement de purification des fragments obtenus lors d'une digestion : pCR-GAI digéré avec BamH1 et Hind III, 2 sites de restriction pour chaque enzyme. On obtient 4 fragments, on désire obtenir un fragment de 704 pb (la moitié 5' du gène), qu'on liera sur un autre plasmide pSK lui aussi coupé par ces deux enzymes (pour avoir les bonnes extrémités). Ce plasmide pCR fait 5484 pb.

En réalisant une électrophorèse sur la purification obtenue, on obtient les concentrations finales des fragments (dont le 5'gai de pCRgai, estimé à 5ng/µl, ce qui est peu), en comparant la "luminosité" des bandes.

Sachant que Rendement = (Concentration après purification) / (concentration avant purification), il me manque donc la concentration avant. On connait la concentration d'ADN (donc celle du plasmide) présente initialement. Cependant, pour connaitre celle des fragments présents (donc l'extrémté 5', après digestion) j'essaye cette formule : (Concentration ADN * (784/5484)). Donc

Rendement = (( Concentration ADN plasmidique ) * (785/5484)) / ( Concentration finale). Qu'en pensez vous? Merci.
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[invite39bf6904]

Je crois, la concentration initiale de l'ADN plasmique initiale EST juste la concentration initiale du fragment digéré dont tu as besoin, parce que pour un plasmide, il n'existe qu'UN fragment de 784 bp qui est celui que tu cherches (la moitié 5' du gène, oui ?). Les autres ne sont pas ceux dont tu as besoin. Donc, il n'est pas nécessaire de multiplier la concentration de l'ADN plasmique par le nombre des fragments théoriques (5484/784).

Donc, Rendement = (Concentration finale) / (concentration de l'ADN plasmique)

[invite9c78a1ce]

D'accord, c'est bien la moitié du gène 5' qu'on cherche à étudier. Je pensais que c'était plus compliqué. Merci alors. Tu tiens d'où cette info, t'as déjà réalisé ces calculs?

[invite9c78a1ce]

Je profite de topic pour vous demander autre chose. Je dois aussi réalisé une PCR. J'ai lu mon cours, le topic dessus sur Futura, mais je me demande quelque chose. Je dois faire un génotypage de plante, et je ne connais pas la concentration en ADN (donc en matrice). Quellle doit être la proportion en matrice? Je ne sais pas si c'est les profs qui vont me la donner.

[A voir en vidéo sur Futura]