[Cyto"gramme"] abs & ordonnée?

[invitec38e3ca5]

Bonjour à tous!!
En fait ce matin j'ai pu capturer une photo que le prof nous avait fait, mais je ne sais pas quelle unité est exprimée en abscisse et en ordonnée!!
Déjà il s'agit d'un examen typique de cellules LLC (leucémie lymphoïde chronique)
Moi je dirais qu'on peut avoir comme paramètres fluorescence et population cellulaires et une foule d'autres que permet d'avoir la cytométrie (granulosité...) Mais en fait je n'en sais rien, j'ai pas compris.

Ce que je voudrais savoir, ça peut paraître bête et flou mais: c'est qu'est ce qu'on mesure en abscisse et qu'est ce qu'on mesure en ordonnée, et quel est l'intérêt de mesurer ceci en fonction de cela?



Sur un schéma dans notre cours, on a un peu le même genre de schéma avec un nuage de points, et c'est appelé "analyse bidimensionnelle de la fraction des cellules en S (IM) et de la ploïdie"

En fait on y voit:
En abscisses: "l'ADN (iodure de propidium) [=> ce qui expliquerait le rouge]", de 0 à 1000,
En ordonnée la "BRdU (FITC) de cellules", de 10^0 à 10^4.

Il a distingué 3 nuages de points: un nuage encadré "G1" (jusqu'à 10^1 et vers 200), un nuage encadré "S phase" (de 200 jusqu'à 400 mais à 10^3) et un nuage encadré "G2/M" (jusqu'à 10^1 et à 400)
Mais je comprends pas pourquoi on exprime un nombre de cellules en fonction de l'ADN!! J'ai bien compris qu'on pouvait utiliser de l'iodure de propidium et du FITC, mais après je suis encore un peu perdu!!
Merci d'avance!!
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[invite4ff72fd5]

Ici les axes de coordonnées représente la nature des cellules en fonction du marqueur utilisé.

Ton graphes comporte 4 parties limitées par les barres qu'on voit sur ta photos :


(ordonnés = 1 marqueur)
|A|B
|----
|C|D
|_______ (axe des abscisse = 1 marqueur)


En zone A tu as tes cellules uniquement positives pour le marqueur des ordonnées.
En B tu as les doubles positif pour les marqueurs abscisse et ordonnés.
En D simple positif x
En C double négatif.


Ainsi en fonction du marqueur que tu doses (grace à l'anticorp couplé au fluorochrome) tu peux discriminer des populations de cellules.


J'espere avoir été clair

[invite4ff72fd5]

Tiens je t'ai fais un schema plus clair vite fait

Les grosses patates sont tes nuages de points

En gros dans ton cas ils comptent les cellules dans les différentes phases de réplication. C'est pourquoi ils dosent la quantité d'ADN dans un cas avec l'iodure de prop.

[invitec38e3ca5]

Oui merci en fait c'est très clair, dit comme ça!!
Je vois ce qu'on mesure en abscisse et en ordonnée: il s'agit de 2 marqueurs. Et le marqueur est coloré (ou ... "immunofluoré")

Par contre j'ai un mal fou à voir à quoi cela peut servir.
Nous on a vu par exemple qu'on pouvait fixer du FITC aux cellules, sur les protéines, par immunofluorescence, et l'iodure de propidium sur l'ADN entre les bases je crois.
Ca fait bien une sorte de double marquage?

Mais à quoi ça servirait d'exprimer un nombre de cellules en fonction de la quantité d'ADN? (en formulant la question je crois que je commence à imaginer la réponse)
En quoi on peut distinguer les phases S, G1 et G2/M avec ces marqueurs?
Pour les cytométristes, on nous a dit de la ploïdie qu'il s'agissait de mesurer la quantité d'ADN présente. Une altération de ce nombre donnerait une aneuploïdie.


Sur ses exemples de leucémies, on a vu aussi comme marqueur les CD, ou clusters de différenciation, contre lesquels se dirigent des anticorps.

Edit: merci pour le schéma, j'étais en train de rédiger ma rép
En fait c'est justement ça que je ne parviens pas à voir: où on voit les différentes phases de réplication?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitec38e3ca5]

Arf, en fait je crois que je commence à comprendre l'intérêt de la manoeuvre: c'est nous faire toucher du doigt ce cycle cellulaire justement!! (que je ne comprends pas très bien, même s'il nous dit sans cesse que c'est élémentaire)
Il faut m'arrêter si me trompe!!


En fait en phase G1, on a notre quantité diploïde d'ADN (2...00), et on a 10^1 cellule au maximum. Sur un autre graphe très connu, ça correspond à notre fameux pic G1.
Ensuite on a une phase S, ou le nombre de cellules double, puis où l'ADN est multiplié par 2, puis où le nombre de cellule diminue.
Enfin, la phase G2/M, où on est tétraploïde (4...00) mais on retombe à 10^1 cellule...

Je crois que l'exemple que j'ai pris en photo c'était le cas un peu plus compliqué avec des cellules lymphoïdes!!

Edit: http://lh5.ggpht.com/Alegs89/SOYsxMZ...s800/image.jpg
Le schéma du cours!

[invitec38e3ca5]

Tout d'abord désolé du triple post, ma compréhension passe par une étape de bazar assez intense!!

Tiens je t'ai fais un schema plus clair vite fait

Les grosses patates sont tes nuages de points

En gros dans ton cas ils comptent les cellules dans les différentes phases de réplication. C'est pourquoi ils dosent la quantité d'ADN dans un cas avec l'iodure de prop.

En fait tout s'éclaircit progressivement, mais je ne comprends pas ce que signifie la positivité ou la négativité pour une quantité d'ADN.

Merci beaucoup pour les réponses déjà données!!

[invite4ff72fd5]

Tout d'abord désolé du triple post, ma compréhension passe par une étape de bazar assez intense!!



En fait tout s'éclaircit progressivement, mais je ne comprends pas ce que signifie la positivité ou la négativité pour une quantité d'ADN.

Merci beaucoup pour les réponses déjà données!!

En fait quand je dis "positif" ou "négatif" c'est un abus de langage, car souvent la cyto on l'utilise pour reperer certains recepteurs sur les cellules comme par exemple les lymphocytes CD4 ou CD8, donc une cellule CD4 positif (CD4+) voudra dire qu'elle possede le recepteur CD4.

Dans ton cas pour l'ADN oublie ce que j'ai dis (positif/négatif) mais pense plutot en terme de présence ou non du marqueur qui permet de discriminer tes cellules

[invitec25c96a0]

Bonjour,

Il me semble qu'il y a une confusion de votre part. les axes X et Y expriment des intensités pour le marqueur étudié et non pas un nombre de cellules. Par exemple la région G1 mesure en X une intensité de fluorescence (iodure de propidium). la population G1 "tombe" dans le canal 200. Cette population G1 est négative pour le BrdU en Y. Normal, étant donné que le BrdU ne s'incorpore que dans les cellules en phase S (phase de synthèse de l'ADN).
La phase S se caractérise par un marquage positif pour le BrdU avec une intensité de marquage supérieure à 10.
Ce type de double marquage est utile lorsque par exemple vous étudiez un composé qui agit sur le cycle cellulaire. Dans les services de cancéro dans l'industrie pharma l'étude du cycle par marquage avec l'iodure est très courant.

bon courage


cordialement

[invite5005e1fa]

Juste une petite precision, en fait la couleur sur les plots n'a rien a voir avec le propidium iodide (PI), il s'agit juste d'une couleur pour differencier les cellules. Cela peut etre parametre dans le logiciel d'aquisition et donc la couleur pourra etre bleue verte,etc... Il ne faut pas se fier a cela (pas que tu penses que a chqaue fois que tu verras des plots avec des points rouge on parlera de PI).

P.S: Pour la petite anecdote les plots sont assez horribles. Soit over-compenses, soit under-compenses.

[invitec38e3ca5]

Merci pour toutes ces infos!!
@ Spillou => Effectivement pour les couleurs le professeur nous avait dit en une courte phrase que les ordinateurs pouvaient donner une couleur particulière, et il me semble que dans les caryotypes ce soit l'ordinateur qui donne cette variété de couleurs, non?

@ sansplomb => D'accord pour la BrdU

les axes X et Y expriment des intensités pour le marqueur étudié et non pas un nombre de cellules

En fait ce que j'ai compris c'est bien que ces marqueurs sont conjointements exprimés par la BrdU (en Y) et par l'iodure de propidium... (en X)!!
Si je comprends bien c'est que la BrdU s'insère dans la double hélice en phase S, par l'intermédiaire d'une sonde, qui est une portion d'ADN...!! Et cette portion d'ADN-sonde qu'on a greffé en quelque sorte sur les ADNs natifs, on peut y adjoindre un des fluorochromes (via anticorps sur brome), avec par exemple en l'occurrence du FITC...?! (coloration verte!)
Mais l'iodure de propidium... s'insère "carrément" dans l'ADN en le cassant!! (d'ailleurs c'est pourquoi cette substance est cancérigène)

Donc je ne comprends pas comment en mutilant l'ADN avec d'un côté les sondes FISH marquées par FITC et d'autre part l'iodure de propidium on peut obtenir quelque chose!!

A MOINS que l'iodure de propidium ne mesure en quelque sorte un taux d'ADN initial et le BrdU ne soit là pour marquer la différence avec un second état...!!

@ Mantos =>

Dans ton cas pour l'ADN oublie ce que j'ai dis (positif/négatif) mais pense plutot en terme de présence ou non du marqueur qui permet de discriminer tes cellules

Autant je vois bien justement pour une cellule quels marqueurs on peut utiliser, mais c'est plus difficile pour l'ADN: sont-ce les adénines, les thymines? Est-ce le brome inséré par la BrdU?


J'espère que mes interrogations sont assez claires...!!

[invite4ff72fd5]

Ici ils dosent la quantité d'ADN, car suivant tes phases de réplication (division cellulaire) ton ADN passe de n à 2n .

Ainsi, pour faire simple, en marquant l'ADN avec l'iodure de propidium plus l'intensité est forte, plus il y a d'ADN et ainsi tes cellules se trouvent donc dans telle ou telle phase de réplication.

[invitec38e3ca5]

... ou de 2C à 4C, ou encore de 3 pg d'ADN à 6 pg d'ADN?
Mais on peut n'utiliser qu'un seul colorant en fonction du temps alors?
Pourquoi utiliser de la BrdU marqué par du FITC en complément?

Merci!

[invite4ff72fd5]

Chaque marqueur sera spécifique d'une phase surement.

Les 2 marqueurs sont là pour faire un rapport de l'un par rapport à l'autre.

Sinon je t'invite à lire ceci (en anglais ) concernant BrdU

http://en.wikipedia.org/wiki/BrdU

[invitec38e3ca5]

D'accord, en fait le BrdU est un marqueur de phase S, et l'iodure de propidium est un marqueur interphasique je crois, donc phase G1.

En tout cas merci pour toutes ces réponses!!