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Evolution de la fluorescence au cours du temps



  1. #1
    Mrikzik

    Evolution de la fluorescence au cours du temps


    ------

    Bonjours à tous,
    Pendant un TP où j'étudiais la fluorescence de la tyrosine (Ab à 280 ém à 340 env), nous avons vu que l'intensité de la fluorescence baisse de 20 à 30% pendant la première minute d'exposition au rayon incident puis se stabilise.
    J'ai beau retourner le problème dans ma tête je ne comprend pas ce phénomène.
    L'inverse aurais été plus facilement interprétable.
    Es ce que quelqu'un connait le mécanisme?
    Je devrais peut être poster en physique ou chimie?

    Merci pour vos réponses.

    -----

  2. #2
    IngDr

    Re : Evolution de la fluorescence au cours du temps

    En microscopie par fluorescence, on appelle photoblanchiment (photobleaching) la perte de fluorescence du fluorochrome induite par l'exposition à la source lumineuse. En fait, les macromolécules fluorescentes ne fluorescencent pas indéfiniment. L'énergie restituée lors de l'émission du photon de fluorescence étant toujours inferieure à l'énergie reçue pour faire changer un électron de couche électronique, la différence est transformé en chaleur (et autre, mais je ne me souviens plus quoi ...), entrainant ainsi une dégradation du fluorochrome.
    Maintenant est ce qu'on peut observer le même phénomène sur un acide aminé isolé, je ne sais pas. D'autant que l'intensité semble se stabiliser.

  3. #3
    IngDr

    Re : Evolution de la fluorescence au cours du temps

    A priori ca doit être du photoblanchiment, regarde là :
    http://www.informaworld.com/smpp/con...2710252~db=all

  4. #4
    Mrikzik

    Re : Evolution de la fluorescence au cours du temps

    Merci pour vos réponses,
    Je suis désolé, je m'aperçois que j'ai fait une erreur, ce n'ai pas la fluorescence de la tyrosine mais celle de l'avidine. J'ai confondu même si la fluorescence de l'avidine est probablement due en bonne partie à la tyrosine (encore désolé ).
    Cependant je ne pense pas que ce soit l'explication.
    Nous avons mesurer la fluorescence a plusieurs reprises et la baisse n'est pas progressive au fur et a mesure des mesures.
    C'est dans la première minute lorsque je viens de mettre la cuve dans le spectro, la fluorescence baisse puis se stabilise à une valeur.
    Et ce a chaque fois que je remet l'échantillon en contacte avec le rayon. C'est bien sûr toujours le même échantillon (dans lequel je rajoute de la biotine au file des mesures).
    Merci

  5. A voir en vidéo sur Futura
  6. #5
    Morphine

    Re : Evolution de la fluorescence au cours du temps

    Bonjour,

    tu observes une variation du signal de fluorescence lorsque tu ajoutes la biotine?
    Car, si c'est bien celà que tu observes, je pense avoir une idée expliquant ce phénomène.
    L'avidine interagit très fortement avec la biotine. Cette interaction doit alors induire un changement conformationnel de l'avidine pour permettre le maintien de cette interaction. Ce changement conformationnel induit probablement une variation d'exposition au solvant de ton fluorophore, ici les tryptophanes de l'avidine.
    La fluoresence des tryptophanes est fortement dépendant de l'exposition au solvant et aux autres acides aminés environnants (voir phénomène de quenching).

    Une fois la totalité de lavidine saturée par la biotine, tout ajout de biotine n'influera donc plus sur la fluoresence mesurée, car il n'y aura plus d'avidine libre. De mémoire l'interaction avidine-biotine doit est de l'ordre de 10exp(-14)M.

    Morphine

  7. #6
    Mrikzik

    Re : Evolution de la fluorescence au cours du temps

    Salut Morphine et merci pour ta réponse.
    Mais ce n'est pas non plus le phénomène que je recherche.
    Dans le protocole de TP il est dit que lorsque l'on met la cuve dans le spectro d'attendre que la fluorescence se stabilise avant de relever la valeur. Effectivement on observe la fluorescence diminuer jusqu'à se stabiliser au bout d'une minute d'exposition dans le specto.
    Au file des mesures (qui sont différenciées par la quantité de biotine présente) la valeur (après stabilisation) de fluorescence diminue, comme tu l'as expliqué a cause du changement de conformation de l'avidine).
    Ce que je ne comprend pas c'est pourquoi la fluorescence a besoin d'une minute pour se stabiliser.
    Pour moi l'absorption et la réémission d'un photon prend moins d'une micro seconde, alors pourquoi 1 minute "d'adaptation"?

    Sinon comme tu as l'air de connaitre comment se passe la fixation je me permet de te poser une autre petite question .
    Comme tu l'as dis, après avoir rajouté 12 microL de biotine la fluorescence n'évolue plus (ou presque plus). C'est donc, si je comprend bien le point d'équivalence du dosage.
    Sauf que d'après mes calcules il y a mole à mole 2 biotine pour 1 avidine alors que l'avidine est capable de fixer normalement 4 biotines.
    Es ce que cela veux dire que mon avidine est trop vieille? J'ai refait plusieurs fois les calcules, pas d'erreur possible de ce côté.
    Es ce que tu sais (ou qq1) d'où ça peut venir?
    Merci

  8. #7
    Morphine

    Re : Evolution de la fluorescence au cours du temps

    Bonjour,

    je n'ai pas d'idée expliquant pourquoi tu ne trouves qu'un rapport de 1 pour 2.
    Comment as tu doser les quantités d'avidine présentes en solutions?
    Tu surestimes peut etre cette valeur.

    Ceci dit, il me semble effectivement possible qu'une partie de ton avidine ne soit plus capable de fixer de la biotine. Que tu trouves un rapport inférieur à 4 me semble parfaitement logique. Mais, on aurait pu s'attendre à une valeur au moins supérieur à 3.

    Concernant ton problème de flurorescence qui met un temps à se stabiliser, je vais demander autour de moi et je te tiendrais au courant.

    Morphine

  9. #8
    Mrikzik

    Re : Evolution de la fluorescence au cours du temps

    Citation Envoyé par Morphine Voir le message
    Bonjour,

    je n'ai pas d'idée expliquant pourquoi tu ne trouves qu'un rapport de 1 pour 2.
    Comment as tu doser les quantités d'avidine présentes en solutions?
    Tu surestimes peut etre cette valeur.

    Ceci dit, il me semble effectivement possible qu'une partie de ton avidine ne soit plus capable de fixer de la biotine. Que tu trouves un rapport inférieur à 4 me semble parfaitement logique. Mais, on aurait pu s'attendre à une valeur au moins supérieur à 3.

    Concernant ton problème de flurorescence qui met un temps à se stabiliser, je vais demander autour de moi et je te tiendrais au courant.

    Morphine
    Salut,
    nous disposons d'une solution d'avidine à 0,25 ug/uL. J'ai mis 60 uL de cette solution pour avoir 15ug dans ma cuve.
    Je me suis renseigné aussi la où je pouvais et apparemment c'est un résultat normale. trouver 4 est quasiment impossible, mon 2 pourrait s'expliquer par le tampon (0,1M acétate pH 6,5) qui n'est a priori pas adapter.
    Merci pour ton aide
    A+

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