Linker, enzyme de restriction and co

[invite581e8cdd]

Bonsoir !

Je n'ai pas très bien compris ce qu'était un (poly)linker. Je crois que c'est une séquence qui est reconnue par de nombreuses enzymes de restriction mais à qu'est ce que c'est précisément?

En outre, notre prof a précisé que la DNA ligase coupait aussi bien les extremités franches que cohésives mais qu'il était préférable que ce soit des extrémités cohésives, je n'ai pas bien compris pourquoi ?

Enfin qu'est ce que le polissage des extrémités ? La prof nous a parlé d'une méthode où on avait méthylation des sites EcoR1, polissage des extrémités puis addition de linkers. Je n'ai pas très bien compris à quoi servait cette méthode.

Que va-t-on faire si l'ADN insert est coupé par un ou des enzymes non compatibles avec le polylinker ?

Bref, tout cela est un peu confus. Désolée si je n'ai pas été claire.

Merci
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[invite17a570c1]

Hello et bienvenue

Je n'ai pas très bien compris ce qu'était un (poly)linker. Je crois que c'est une séquence qui est reconnue par de nombreuses enzymes de restriction mais à qu'est ce que c'est précisément?

Un polylinker est une région d'un plasmide contenant plein de sites de restriction, souvent uniques. Ce sont ces divers sites qui sont reconnus par les enzymes respectives. Tu peux rencontrer aussi le terme MCS, pour Multiple Cloning Site (ou Site de Clonages Multiples).

En outre, notre prof a précisé que la DNA ligase coupait aussi bien les extremités franches que cohésives mais qu'il était préférable que ce soit des extrémités cohésives, je n'ai pas bien compris pourquoi ?

Euh, la ligase ne coupe pas, elle lie
Après, il s'agit de cas divers. Disons que si tu clones un insert dont chaque extrêmité a été générée par une enzyme différente (par exemple, EcoRI et BamHI), tu fais pareil au niveau du plasmide receveur (au niveau de son MCS justement ) et tu ligues à l'aide de la ligase. Dans ce cas, tu sauras que tu as de très grandes chances d'avoir ton insert cloné dans la bonne direction.

Enfin qu'est ce que le polissage des extrémités ? La prof nous a parlé d'une méthode où on avait méthylation des sites EcoR1, polissage des extrémités puis addition de linkers. Je n'ai pas très bien compris à quoi servait cette méthode.

Je ne suis pas sûre de suivre ça, donc je laisse quelqu'un de plus averti que moi expliquer

Que va-t-on faire si l'ADN insert est coupé par un ou des enzymes non compatibles avec le polylinker ?

Beh même si tu mets 3L de ligase, tu n'auras pas de clonage Excepté le cas où une recombinaison peut se produire entre une région du plasmide et l'insert et à condition que l'ADN linéaire que représente ton insert ne soit pas détruit, tu pourras éventuellement avoir un truc recombinant.
Mais comment veux-tu introduire un bout de kékchose dans un truc fermé? C'est une question de réflexion là



Hope that helps

[invite581e8cdd]

merci beaucoup pour ta réponse rapide et effectivement j'ai dit n'importe quoi pour la ligase...(qui comme son nom l'indique lie effectivement)....
merci

[invite581e8cdd]

si quelqu'un a des idées pour le polissage des extremites ?

[A voir en vidéo sur Futura]