Extraction et dosage des protéines

[invitecc2a5091]

Bonjour à tous!

Je souhaiterais extraire des protéines issues de placentas humain.
Mes prélèvements sont sanglants alors je les laves repidement au CaCl2 puis sérum physiologique en disséquant un peu les cellules qui m"intéressent particulièrement.
Ensuit je transfert le tout dans du Ripa et j'extrait les protéines. Je me retrouve encore avec plus ou moins de cellules sanguines dans ma solutions dues à la lyse. Je n'ose pas l'éliminer car se trouvent également mes protéines d'intêret. Ceci affecte mon dosage (méthode de Bradford). Je suis obligée de beaucoup diluer pour éviter ce dosage parasitesui de plus et inégal selon mes échantillons. En fait quand je colore au bleu de coomassie un gel contenant mes protéines après électrophorèse, je m'aperçois que je ne retombe pas sur mon dosage (certains profils protéiques sont plus intenses alors que moins concentrés que d'autres lors du dosage). comment me débarasser de cette "contamination" sans altérere mes protéines d'intêret?
merci pour vos réponses
Amicalement
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[Zellus]

Bonjour,

Vous ne pouvez pas faire de centrifugation pour éliminer les cellules sanguines restantes ?
Le problème, c'est que s'il vous reste des cellules sanguines dans ce lysat (si j'ai bien compris), votre solution n'est pas homogène et vous pouvez pipeter plus ou moins de cellules et donc obtenir des résulltats différents d'une fois à l'autre.
De plus, lorsque vous dosez au Bradford, vous dosez les protéines libres dans votre solution. Mais avant de déposer sur votre gel vous mélangez votre solution avec du dénaturant et chauffez un peu non ? Vous allez alors lyser les cellules sanguines présentes encore dans votre solution et libérer les protéines qu'elles contiennent et qui n'avaient pas été dosées au Bradford.
C'est l'explication que j'ai pour le moment. J'espère avoir été clair et ne pas avoir répondu à côté.

[invitecc2a5091]

En fait, lors de la lyse de mon tissu avec le Ripa, j'extrait en même temps que mes protéines tissulaires, des cellules sanguines qui n'avaient pas été éliminées lors de mon lavage de tissu lors du prélèvement. Je crois que je n'ai plus qu'à diluer au maximum même si je suis dans la limite du dosage. merci en tout cas.

[invitebe208abd]

salut,

je pense effectivement qu en effectuant une centrifugation différentielle tu peux arriver a separer tes cellules d interet des cellules sanguines

[A voir en vidéo sur Futura]