Pcr

[invite12bf6e4e]

Bonjour

j'ai ma PCR 16S qui ne marche plus ce qui m'énerve prodigieusement! j'ai changé tout mon matériel, testé des souches différentes dont certaines avaient déjà été amplifiées correctement mais rien n'y fait. C'est arrivé d'un coup je ne comprends pas. si quelqu'un a un protocole à me proposer je suis pas contre....
mais ma question est la suivante : je sais que si je mets trop d'ADN dans ma réaction, il peut se produire une inhibition de la PCR mais quelle quantité mettre en moyenne?

merci pour vos réponses
ciao
-----

[piwi]

Quand vous dites avoir tout testé c'est tout? Les primers? La Taq?

[inviteb8b35cb0]

Bonsoir,

Après avoir extrait l'ADN, tu peux faire un gel d'agarose pour estimer la quantité de ton extrait ou bien le doser au spectro à 260 nm.
Pour te rassurer, le problème que tu rencontres m'est déjà arrivé. Nous avions tout changé, nouveaux aliquots de primers, de dNTP, de Taq puis un beau jour, le problème s'est résolu sans jamais savoir pourquoi. Il faut toujours travailler sur glace et bien faire des aliquots.
Bonne chance et surtout ne désespère pas

[invite12bf6e4e]

j'ai changé les primers, le tampon 10X, les dntp, les amorces, les MgCl2, la taq, l'eau du mix. j'ai changé de labo pour faire la PCR et rien n'y fait.... je pense que le problème vient de moi mais le problème c'est que mes autres PCR marchent. ferais-je un blocage sur la 16S?? mystère je continue à essayer...
A +

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

Si ça ne vient de rien de ce que vous avez testé c'est que ça vient de l'extraction de l'ADN

Cordialement,
piwi

[invite12bf6e4e]

ben justement non car les échantillons que je prends comme témoins positifs sont des échantillons que j'avais déjà amplifiés sans difficulté. hier j'ai augmenté les doses en amorces et enzymes: ça a marché! youpi!
merci pour vos réponses

[piwi]

Il y a probablement un de vos réactifs qui n'est pas à la concentration que vous pensez. Vous amorces sont nouvelles ou c'est un vieux lot?

[invite12bf6e4e]

les amorces sont neuves : voyant que ma réaction ne marchait pas, j'en ai recommandées.
de nouveau aujourd'hui ma réaction 16S ne marche plus, meme en augmentant les quantités de taq et d'amorces. je craque....pourtant mes autres PCR sont OK. je ne comprends pas et ça me prend bien la tete.

[piwi]

Si vous voulez vous assurer de vos échantillons le plus simple (puisque tout a été changé) est de refaire une extraction d'ADN bien propre et de voir si là ca fonctionne ou pas.

[invite0e9887ab]

Bonjour,

Il serait peut-être également intéressant de demander à quelqu'un d'autre de faire la pcr. Lui demander de repartir des stocks d'amorce qui ont été livrés, d'utiliser ses aliquos de dNTP, etc.
Peut-être y a-t-il une petit problème quelque part dans la manip mais qu'à force de la refaire vous ne le voyiez plus.