Technique SELEX aidez moi!

[invite95eff194]

slt

j'ai de la misère à comprendre la technique SELEX, est ce que quelqu'un pourrait m'aider, je vous remercie d'avance.
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[piwi]

Oui.

Il faut voir cela en plusieurs étapes.
Pour faire simple (on entrera dans le détail ensuite si vous le souhaitez)
1. créer un grand oligonucléotide matrice avec trois choses: deux sites d'amorce sens et antisens. Un région centrale (20-25 ntd) que l'on synthétisera pour chacun des oligo de manière aléatoire.
Ainsi on a une collection d'oligo de régions aléatoires portées sur des oligonucléotides bordés de sites d'hybridation pour deux amorces.
On se procure aussi les deux oligonucléotides sens et antisens.

Armé de cela on va réaliser un PCR qui va nous permettre d'amplifier nos matrices. On a donc un grand nombre de matrices aléatoire.

2. On produit une protéine que l'on va fixer sur une résine. Procéder avec des anticorps coute cher vu qu'il faut renouveler les billes à chacune des étapes... On procèdera plutôt avec une protéine taguée avec des trucs du genre polyHis (pET), GST (pGEX), Halo (pHaloTag), etc...
Bien! Les billes sont sur la colonne.

3. On met en présence la PCR et les protéines.
Comme nous avons généré un grand nombre de fragments d'ADN aléatoire, si notre protéine a une affinité pour l'ADN, elle trouvera son site de fixation. On rince et on élue.
Ce que l'on élue est donc les fragments d'ADN qui étaient restés fixés sur la protéine. Afin d'éliminer les séquences aspécifique on va procéder par plusieurs réitération du processus. (PCR, fixation, élution). Ceci va avoir pour conséquence que les fragments ayant la plus forte affinité pour la protéine se fixeront les mieux. On en récupéra donc plus après l'élution. Ils seront donc plus amplifiés par PCR etc... Donc à chacune des itérations, on amplifie l'extrait en fragments spécifiques.
Une des difficultés du SELEX est de savoir où s'arrêter. Trop tôt, on a encore trop de fragments divers. Trop tard, il ne reste plus qu'un fragment hyper spécifique mais qui n'existe peut être pas dans la nature. Difficile ensuite de faire une analyse bio info pour le resituer dans son contexte. Dés lors, ce que l'on cherche c'est un juste milieu (une dizaine de cycles) pour pouvoir obtenir une séquence consensus.

3. On disposent de fragments qu'on espère pouvoir exploiter pour obtenir la séquence consensus. Ce que l'on va faire c'est simplement un clonage des fragments. Des colonies seront piquées, amplifiées puis séquencées. L'analyse de toutes les séquences nous donnera la séquence consensus.

Voilà le principe.
Une nouvelle fois, si vous voulez des détail plus technique de procédure. On peut y revenir. Si un point vous échappe encore, n'hésitez pas à me redemander.

Cordialement,
piwi

[invite95eff194]

un grand merci pour ton aide.

[invite160a5434]

Bonjour,

Pardon Piwi mais je n'ai pas très bien compris la dernière étape (3) concernant la séquence consensus.
Quel est le but du clonage et des colonies ?

Merci pour tes explications.

PS : Vous travaillez toutes les techniques de bio en labo ou la méthode selex est à la pointe en ce moment ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

A la fin vous allez récupérer des fragments que vous souhaitez identifier. Ce que vous savez à priori c'est qu'ils vont tous être similaires à priori avec de petites variations. Ce que vous souhaitez c'est établir une séquence consensus de fixation de votre protéine.
Pour cela vous allez prendre votre éluat et vous allez mettre vos fragments dans des plasmides et les cloner en bactéries. Chacune des bactérie porte un clone qui lui même porte un fragment. Ainsi vous séparez vos différents fragments. Il ne vous reste plus qu'a reprendre vos clones, extraire les plasmides et les séquencer un par un. Vous allez donc avoir une collection de fragments identifiés qui vont vous permettre de déterminer une séquence consensus de fixation.

C'est plus clair ainsi ou ça accroche encore?

Je ne sais pas si le SELEX est à la pointe en ce moment, mais oui, je bosse dessus et d'une manière générale je suis amené à m'intéresser de près à pas mal de techniques de biologie moléculaire.

Cordialement,
piwi

[invite160a5434]

Okay, c'est cool, merci, je comprends mieux.

Mais pour ce genre de recherche, le foot printing n'est pas plus simple ?

[piwi]

Ben... Le foot print c'est la jolie technique sur le papier. Après, quand il faut mettre les mains dedans tout change. Donc non, ce n'est pas plus simple techniquement. Ensuite pour faire un foot print il vous faut connaitre une région de liaison supposée pour votre protéine. Quand vous n'en avez pas, tout se complique.
Enfin à priori le foot print vous donne un région que vous pouvez circonscrire au mieux mais il ne donne pas la séquence de liaison. Certes on peut la retrouver (même sans bio info) mais alors vous n'aurez qu'une séquence de liaison, pas un consensus. Vous n'êtes pas absolument certain de savoir transposer cette séquence ailleurs dans le génome.

Pour le selex le processus intellectuel est différent. Vous identifiez une séquence puis vous regardez dans le génome où on peut la trouver.
D'ailleurs une fois que vous avez cette séquence vous devrez quand même montrer que la protéine se fixe bien sur l'ADN in vivo

Cordialement,
piwi