Maltose et MgSO4, quelle utilité?

[invite954f36b6]

Bonsoir,

Je suis en deuxième année de dut génie biologique, et nous avons eu récemment un tp de biologie moléculaire d'étude d'un adn complémentaire, avec utilisation de plusieurs techniques (infection, pcr puis électrophorèse sur gel d'agarose). J'ai quelques questions de détail sur notre protocole:

- tout d'abord, lors de l'infection, on cultive les bactéries dans un tube contenant du milieu LB liquide, du MgSO4 et du maltose. Pourquoi ajouter ces deux éléments au milieu?
Je pense à des facteurs de croissance, au moins pour le sulfate de Mg, et pour le maltose plutôt à une source de carbone alternative au glucose, toujours pour dopper la croissance. Est-ce bien ça?

- Lors d'une électrophorèse d'ADN de rat non digéré, on a visualisé à la fin une seule bande, qui correspondait à un poids d'environ 20-25 kb. Pourtant, on devrait avoir plusieurs bandes, correspondant chacune à la longueur en ADN d'un chromosome. Pourquoi a-t-on seulement une bande?

- et enfin, question de visualisation de l'infection du début: on met des phages dans le tube pour réaliser l'infection. L'infection, est-ce "un phage infecte une bactérie", ou bien plusieurs phages peuvent-ils infecter une seule et même bactérie?

Merci d'avance pour vos éclaircissements.
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[gorben]

Salut,

Bonsoir,

Je suis en deuxième année de dut génie biologique, et nous avons eu récemment un tp de biologie moléculaire d'étude d'un adn complémentaire, avec utilisation de plusieurs techniques (infection, pcr puis électrophorèse sur gel d'agarose). J'ai quelques questions de détail sur notre protocole:

- tout d'abord, lors de l'infection, on cultive les bactéries dans un tube contenant du milieu LB liquide, du MgSO4 et du maltose. Pourquoi ajouter ces deux éléments au milieu?
Je pense à des facteurs de croissance, au moins pour le sulfate de Mg, et pour le maltose plutôt à une source de carbone alternative au glucose, toujours pour dopper la croissance. Est-ce bien ça?

Ce sont les "co-facteurs" necessaires a une infection par le phage lambda. Mg2+ pour l'adsorption du phage a la surface, maltose pour induire l'expression de l'operon maltose qui est le recepteur de lambda a la surface des bacteries.

- Lors d'une électrophorèse d'ADN de rat non digéré, on a visualisé à la fin une seule bande, qui correspondait à un poids d'environ 20-25 kb. Pourtant, on devrait avoir plusieurs bandes, correspondant chacune à la longueur en ADN d'un chromosome. Pourquoi a-t-on seulement une bande?

Quelle est la taille d'un chromosome de rat? Crois tu que 20-25Kb soit la taille d'un chromosome?

- et enfin, question de visualisation de l'infection du début: on met des phages dans le tube pour réaliser l'infection. L'infection, est-ce "un phage infecte une bactérie", ou bien plusieurs phages peuvent-ils infecter une seule et même bactérie?

Merci d'avance pour vos éclaircissements.

Generalement tu te places en conditions pour avoir un phage/ bacterie. Mais tu peux avoir infection d'une meme bacterie par plusieurs phages. Par contre, une fois que la bacterie aura un phage integree a son chromosome, plus moyen d'etre re-infectee. Ca s'appelle l'immunisation.

A+

[invite954f36b6]

Merci beaucoup pour les réponses aux questions sur l'infection!

Par contre je ne comprends toujours pas le coup de la bande unique à 20kb sur le gel avec l'adn non digéré.
On a un génome d'environ 3x10^9 pb chez les mammifères, avec (dixit Wikipedia) 42 chromosomes chez le rat. On devrait donc avoir une bande épaisse autour des 60 000 kb.

Par contre je suis en train de penser à la résolution du gel, une molécule de 60 millions de pb est énorme par rapport aux autres molécules que l'ont fait migrer. On a donc peut-être une bande en tout début de gel, non parce qu'elle fait 20-25kb, mais parce que ni le marqueur à 25kb, ni la molécule de 60Mpb ne peuvent migrer sur le gel?

[gorben]

Par contre je suis en train de penser à la résolution du gel, une molécule de 60 millions de pb est énorme par rapport aux autres molécules que l'ont fait migrer. On a donc peut-être une bande en tout début de gel, non parce qu'elle fait 20-25kb, mais parce que ni le marqueur à 25kb, ni la molécule de 60Mpb ne peuvent migrer sur le gel?

Voila c'est exactement ca. La resolution n'est pas suffisante pour faire migrer des chromosomes. De plus lors de ta prep tu as forcement du casser les molecules d'ADN donc meme si en theorie tu as des chromosomes de 60Mb, en pratique tu as des petits bouts d'ADN entre 50 et 100kb (la resolution du gel d'agarose est toujours pas suffisante pour faire migrer ca).

A+

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite954f36b6]

Ok, bien compris. Merci encore!