Mutagénèse/clonage

[inviteec077029]

Bonjour,

Je reprend les manips de quelqu'un qui vient de partir du labo et j'ai déjà peur que sa fonctionne pas parceque c'est une manip qui à déjà été faite mais echec alors j'ai besoin que vous m'aidiez à prendre les précautions nécessaires car je n'ai pas vraiment d'expériences sur ces techniques.
Donc voila j'aimerais faire une mutagènese dirigée sur un vecteur déjà fait (ce qui veut dire précautions!!) construit avec le cDNA d'intérêt intégrés.
Je suppose que vous allez me dire de séquencer pour être sure de ce que j'ai mais vous qui avez de l'expérience qu'est ce qui peut passer inaperçus sous les yeux d'un débutants?
Ensuite quel kit de mutagènese utiliser pour que sa marche du premier coup et quel taq utiliser?
Une fois que la mutagènese est ok je vais passer à la transfection mais sa je vous en parlerais peut être après que je commence à résoudre ces problèmes

Merci pour votre aide
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[invitec9f0f895]

Salut

en effet si l'insert de cDNA n'a jamais été séquencé il faut le faire. Il faut évidemment que tu fasses attention aux eventuelles jonctions exons-introns pour t'assurer que tu as bien un cDNA mature de cloné. ensuite il faut t'assurer qu'il est complet (de l'ATG au STOP) voir meme que tu as quelques parties des régions UTR.

Pour le kit de mutagenèse je te conseille tres vivement le kit de stratagene "quick change mutagenesis". Il est super efficace avec un taux de réussite constat de 80%. Par contre il faut que ton plasmide soit "petit" (plus il est petit mieux ca marche), quite a recloner ton insert dans un vecteur de type pUC19 (au final tu gagneras du temps).

voila

YOyo

[inviteec077029]

Merci Yoyo,
je vais commencer les manips aprés les vacances.
Je vous tiens au courant

[inviteec077029]

Sa marche j'ai enfin ma mutation. Par contre petit conseil pour les prochaines laisser agir plus longtemps qu'une heure avec DPn1 car en piquant 3 colonies 2/3 était sauvage

Merci pour votre aide

[A voir en vidéo sur Futura]