L'ADN mystère !!!

[invite95cc1df8]

Bjr à tous!
Pourriez-vous m'aider à trouver une explication pour ça :
après une PCR pr amplifier le gène codant pr l'ARN 16S chez P. fluorescens nous avons eu sur l'électrophorèse une bande de très forte intensité pour le témoin NEGATIF (et seulement pour celui-ci) correspondant à la même taille que l'ADN test. Nous avons de suite pensé à une erreur de manipulation. Nouvelle PCR en changeant de manipulateur et en évitant tout risque de contamination: même résultat !
s'il s'agissait d'une contamination de l'un des réactifs, on aurait cette même bande pr ts les autres puits, ce ki n'est pas le cas, celles des échantillons étant largemt + faibles. Et s'il sagissait d'une contamination entre tubes test et tube témoin, l'intensité aurait été plus faible ou au pire identik à celles des tubes test.
Cmt est-ce alors possible? il ne peut pa s'agir d'une contamination extérieure par de l'ADN ki serait com par hasard homologue à nos amorces spécifik à P.fluo. et de la mm taille que l'ADN attendu??? ... Génération spontanée !!!??? mdr on C plu koi penser ! Aidez-nous svp!!!
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[invitec9f0f895]

Salut

Il y a quoi dans ton temoin negatif?

YOyo

[invite95cc1df8]

Slt
Composition du témoin négatif:
Eau stérile( 16,5 µL) + Tampon(2,5µL à 10X) + Acétate de Mg (1µL à 25 mM) + dNTP (1µL à 12,5 mM)+ Amorces R et F spécifik(1,5µL*2) + Red Taq (1µL) et surtt pas d'ADN bien sûr

[invite95cc1df8]

Alors ... pas une tite idée ... ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite71f23525]

Quelle est la taille de ta bande (qui ne devrait pas y être) dans le témoin? Avez-vous essayer de procéder par élimination, par exemple un témoin sans les amorces, un témoin sans la taq pour cibler le problème?

Greg

[invite95cc1df8]

dsl pr le retard.
Elle est d'environ 240 pb qq (comme celle du test). J'ai demandé, mais le coût du matériel et des réactifs a refroidit la curiosité de mes partenaires lol et surtout du prof. du coup on en est resté sur le fait ke si c'était l'un des réactifs contenus dans le témoin, on aurait retrouvé la bande dans les tests vu kon avait utilisé les mm réactifs (y compris l'eau stérile)

[invite71f23525]

Je suppose que les amorces font 20-30 bases chacunes, ce qui exclue la possibilité de dimères de primers. Peut-être l'un des réactif est contaminé et une fois que tu met ta matrice, alors il y a compétition entre la matrice d'intérêt et la matrice contaminante, ça explique peut-être la perte d'efficacité de la PCR dans les pistes d'intérêt par rapport au témoin....Toutefois je suis loin d'être convaincu par cette explication mais je vois rien d'autre.

Autre chose, en théorie quelle est la taille de l'amplicon à obtenir avec cette paire d'amorces sur ce gène?

Greg