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Mutagénèse dirigée




  1. #1
    natbiotech

    Mutagénèse dirigée

    Bonjour

    Dans le cadre d'un stage, je suis amenée à faire de la mutagénèse dirigée.
    Bien que je suive le protocole de stratagène, je n'obtiens aucune colonie au final. J'aimerais savoir si d'autres parmi vous aviez rencontré ce genre de problème et comment vous les aviez résolu.
    De plus, existe-t-il des moyens de contrôler les différentes étapes de cette manip (PCR, digestion par DpnI et transfection).
    Merci d'avance

    -----


  2. Publicité
  3. #2
    Moumoutte

    Re : mutagénèse dirigée

    Bonjour,

    pourrais-tu détailler ton protocole et nous dire si c'est exactement ça que tu as fais?
    Ce problème est fréquent mais peut venir de multiples causes.

    Cordialement

  4. #3
    natbiotech

    Re : mutagénèse dirigée

    Alors,

    Dans un premier temps, je fais une PCR avec :
    - 5ng d'ADN à muter,
    - 125ng de chaque amorce (sens et anti-sens).
    Les amorces sont de 28bp avec la base à muter au centre
    - des dNTP à 0.5mM
    - 5µl de tampon 10X (contenant les sels)
    - qsp 50µl
    J'y ajoute 1µl de Pfu Ultra High Fidelity DNA polymerase (Stratagene)
    Ensuite ben je fais la première dénaturation pendant 1min à 95°C
    Puis 12 cycles :
    dénaturation 95°C 30s / Annealing 55°C 1min / Extension 68°C 7min (plasmide de 7kb)
    Et enfin l'extension finale à 72°C pendant 7min.
    Conservation sur la nuit à 4°C (dans le thermocycler)

    Le lendemain c'est la digestion du plasmide méthylé:

    - Je sors le produit de la PCR et y ajoute 1.5µl de DpnI (10U)
    - Mélange à l'aide de la pipette
    - Bain-marie à 37°C pendant 3h

    Ensuite vient la transformation
    - Je sors un aliquot de bactéries DH5alpha sur glace
    - Pour 100µl de bactéries j'ajoute 1µl de produit de la digestion
    - Mélange en tapotant
    - Plonge dans la glace pendant 30min
    - Plonge dans bain-marie à 42°C pendant 45s
    - Remets dans la glace 2 min
    - Ajoute 0.5ml de SOC chaud
    - Incube 45min à 37°C sous agitation

    Puis mise en culture 50µl sur LB-Ampi à 37°C sur la nuit...

    Ce protocole a déjà été utilisé et est censé fonctionner...
    Peut-être que cela vient des bactéries qui ne sont pas des XL1 comme conseillé dans le kit Stratagene...

    Cordialement


  5. #4
    Moumoutte

    Re : mutagénèse dirigée

    Bonjour,

    il y a quelque chose que je ne saisis pas.

    Tu cites:

    Citation Envoyé par natbiotech Voir le message
    Le lendemain c'est la digestion du plasmide méthylé:

    - Je sors le produit de la PCR et y ajoute 1.5µl de DpnI (10U)
    - Mélange à l'aide de la pipette
    - Bain-marie à 37°C pendant 3h
    Tu digères là ton produit de PCR non?
    As-tu plutôt digéré ton plasmide (DpnI avec plasmide) puis fais une étape de ligation pour lier ton produit de PCR au plasmide (avec une ligase)?
    Ensuite, tu transfectes tes bactéries avec ton plasmide transformé.

    D'apres ce que tu as décris, il me semble que tu essayes de transformer les bactéries avec seulement le produit de PCR et que tu ne mets pas le plasmide. Ce dernier, qui doit surement contenir un gène de résistance aux antibiotiques, ne peut donc pas empêcher les bactéries de mourir au contact du milieu LB+ampicilline.

    Pourrais-tu (encore désolé) préciser un petit peu?

    Cordialement

  6. #5
    natbiotech

    Re : mutagénèse dirigée

    La PCR dans ce cas-ci se fait sur l'ensemble du plasmide...
    On obtient alors des plasmides double brins neo-synthétisés. Les plasmides méthylés étant ceux du départ (ne contenant pas la mutation).
    Je fais donc effectivement la digestion sur mon produit de PCR qui n'est autre que mon plasmide...(en théorie, si tout se passe bien)
    J'espère que j'ai été plus claire..

    Cordialement

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Moumoutte

    Re : mutagénèse dirigée

    Ah ok!

    Désolé je n'ai jamais fait ce type de clonage, je ne connais pas trop sic!

    As-tu essayer d'augmenter la quantité de produit de digestion (1µL)?
    Et de quand date ton clonage? Parfois il faut attendre plus longtemps que ce qui est marqué dans le protocole pour voir les premières colonies.

    A+

  9. #7
    natbiotech

    Re : mutagénèse dirigée

    Je suis assez limitée financièrement et donc en réactifs.
    Je n'ai donc pas répété l'expérience...
    J'espérais obtenir des réponses avant de me lancer dans une autre expérience et jeter de l'argent par les fenêtres...
    Mon clonage date de mi-Novembre... Il a été conservé à -20°C tout le temps.

    Merci quand même pour ton aide

    A+

  10. Publicité
  11. #8
    Moumoutte

    Re : mutagénèse dirigée

    Citation Envoyé par natbiotech Voir le message
    Je suis assez limitée financièrement et donc en réactifs.
    Je n'ai donc pas répété l'expérience...
    Oui, je comprends

    Néanmoins, ce genre de problème m'était arrivé une fois et cela avait été résolu en augmentant la quantité de produit pour transformer les bactéries. Donc ça peut vraiment être une solution.

    A ne pas négliger, le fait que tu es choisi d'autres bactéries que celle du kit. Sont-elles compétentes pour une transformation par choc thermique? Est-ce les mêmes que celles utilisées pour les clonages qui ont fonctionné précédemment?

    Citation Envoyé par natbiotech Voir le message
    Mon clonage date de mi-Novembre... Il a été conservé à -20°C tout le temps.
    A+
    On parle bien de ton plasmide? Pas des bactéries (qui préfèrent peut être une conservation à -80°C dans du glycérol)?
    Et puis pourquoi pas: panne de frigo?

    Cordialement

  12. #9
    doubleD

    Re : Mutagénèse dirigée

    Salut

    Est ce que tu as refait ta PCR ? Des mutagenèses dirigées, j'en fait tous les jours et les rares fois où je n'ai pas de colonies, c'est que la PCR n'avait pas marché. En refaisant plus de problèmes.

    Moi je transforme avec 10ul de produit de digestion, je sais pas si ça peut jouer.

    Ou le truc con qui peut arriver, mauvais antibiotique étalé sur la boîte. C'est du vécu...

    Bon courage!

  13. #10
    Moumoutte

    Re : Mutagénèse dirigée

    Bonjour à vous, spécialistes ès mutagénèse dirigée,

    natbiotech a indiqué dans son protocole qu'elle avait réalisée une PCR de 12 cycles.
    J'ai toujours pensé que les PCR devaient avoir un grand nombre de cycles.
    Pourquoi en fait-on si peu dans ce cas-là?

    Merci

  14. #11
    natbiotech

    Re : Mutagénèse dirigée

    Bonjour

    Merci pour vos conseils.

    Tout d'abord, mes bactéries sont bien compétentes. C'est avec elle que j'ai produit mon plasmide à muter.
    Néanmoins je vais vérifier leur efficacité aujourd'hui.

    Sinon pour le nombre de cycles, c'est ce qui est indiqué sur le kit Stratagene pour la mutagénèse d'une base.
    Le pourquoi du comment je n'en sais rien mais serais ravie si quelqu'un avait une explication.

    On parle bien de ton plasmide? Pas des bactéries (qui préfèrent peut être une conservation à -80°C dans du glycérol)
    Je parlais effectivement de mon plasmide.


    Moi je transforme avec 10ul de produit de digestion, je sais pas si ça peut jouer.
    Merci, doubleD.
    J'essaierai avec 10µl.

    Pour l'instant comme je l'ai dit je vais vérifier l'efficacité de mes bactéries et l'état de mon ADN qui a été plusieurs fois congelé et décongelé... Peut-être est-il dégradé...

    Merci encore.

  15. #12
    doubleD

    Re : Mutagénèse dirigée

    Re

    12 cycles, ça permet d'éviter l'accumulation d'erreur de PCR. Moi perso je fais 20 et j'ai pas de problèmes.

    Je te conseille vraiment de refaire ta PCR, et pourquoi pas avec deux cyclages différents: un à 12 et un à 20 cycles.

    C'est souvent la PCR le facteur limitant.

  16. #13
    Moumoutte

    Re : Mutagénèse dirigée

    Citation Envoyé par natbiotech Voir le message
    Pour l'instant comme je l'ai dit je vais vérifier l'efficacité de mes bactéries et l'état de mon ADN qui a été plusieurs fois congelé et décongelé... Peut-être est-il dégradé...
    Effectivement à ne pas négliger non plus!

  17. #14
    chris2003

    Re : Mutagénèse dirigée

    Le problème est probablement résolu depuis belle lurette, mais si quelqu'un est dans le même cas de figure, j'apporte tout de même mon grain de sel. Je pense que le problème est bel et bien que la transformation n'est pas fait dans la bonne bactérie. En effet, les plasmides issus de cette mutagénèse ne sont pas "fermés", ils doivent donc être transformés dans des XL1 qui a la capacité de lier les deux bouts du plasmide. Je ne pense pas que les DH5alpha en soit capables.

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