mutagénèse dirigée

[invite481f0dd7]

salut
je voudrais faire de la mutagenese dirigée chez la levure en 2 endroits distincts séparés d'un peu plus d'une centain de bases.
est ce que ca ne pose pas de probleme? et si oui comment les contourner?
merci
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[Yoyo]

Salut

Pour la muta dirigée : Elle ne se fait que chez coli, sur un fragment d'ADN cloné dans un vecteur. Tu peux mutageneise plusieurs positions simultanément ou les unes apres les autres.
Un kit qui marche vraiment tres bien est le kit "quick change" stratagene. http://www.stratagene.com/products/d...t.aspx?pid=131
en plus tu n'as pas besoin de faire des prep d'ADN simple brin. et c'est une reaction de PCR presque toute simple! en cherchant sur le site tu verras ils ont developpé un autre kit pour la mutagenese multiple.

Yoyo

[invite9e6bc039]

Salut

Pour la muta dirigée : Elle ne se fait que chez coli, sur un fragment d'ADN cloné dans un vecteur. Tu peux mutageneise plusieurs positions simultanément ou les unes apres les autres.
Un kit qui marche vraiment tres bien est le kit "quick change" stratagene. http://www.stratagene.com/products/d...t.aspx?pid=131
en plus tu n'as pas besoin de faire des prep d'ADN simple brin. et c'est une reaction de PCR presque toute simple! en cherchant sur le site tu verras ils ont developpé un autre kit pour la mutagenese multiple.

Yoyo

J'espère que tu plaisantes

Pour répondre a la question, ça dépend de ce que tu veux... Introduire 2 mutations ponctuelles dans un même locus ?

[Jean-Luc P]

En pratique tu fais ta mutagenèse sur E.coli avec des vecteurs puis tu fais de la recombinaison en levure avec les vecteurs obtenus.
Tu ne peux pas faire de la mutagenèse dirigée directement sur un génôme, ça passe par une étape en thermocycleur (comme une PCR mais avec des oligos complémentaires).

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite9e6bc039]

En pratique tu fais ta mutagenèse sur E.coli avec des vecteurs puis tu fais de la recombinaison en levure avec les vecteurs obtenus.
Tu ne peux pas faire de la mutagenèse dirigée directement sur un génôme, ça passe par une étape en thermocycleur (comme une PCR mais avec des oligos complémentaires).

Ben par PCR, c'est pas Coli, me semble-t'il

[Yoyo]

Ben par PCR, c'est pas Coli, me semble-t'il

Je serai curieux que tu m'expliques comment tu fais de la mutagenese dirigée sans utiliser coli!

Yoyo

[invite9e6bc039]

Je serai curieux que tu m'expliques comment tu fais de la mutagenese dirigée sans utiliser coli!

Yoyo

Ben tu fais une PCR et tu transformes directement tes levures; ça marche très bien.

[Yoyo]

et tu selectionnes comment tes mutants par rapport aux sauvages ?

Quel interet de faire cela pour des mutations ponctuelles?

YOyo

[invitece4c4d59]

comme chez coli je suppose, Mais avec des marqueurs d'auxotrophie (et pas de résistance). aprés tu fais peu faire des miniprep comme avec coli pour chercher le bon clone.

bon j'ai jamais fais, mais j'imagine que c'est faisable, juste a mon sens plus chiant que de tout faire chez coli et ensuite de transformer la levure avec le ton plasmide

Sinon c'est vrai que la mutagénèse dirigé se fait par PCR. Coli n'étant là que pour amplifier ton ADN et n'intervenant à aucun moment dans la mutation. Ceci dit c'est un peu jouer sur les mots.

[Yoyo]

Oui en effet c'est jouer sur les mots vu que le criblage se fait chez coli!

Quant a la levure, je n'en vois pas l'interet recuperer un palsmide dans la levure est mille fois plus chiant que de le faire chez coli. Si c'est pour utiliser la capacité de la levure a recombiner alors on fait de la delétion par PCR en effet, mais la on n'est plus dans le cadre de la question initiale...

Enfin bref j'ai jamais vu aucun protocole de mutagenese dirigée utilisant la levure plutot que coli! Biensur si il s'agit de muter un gene d'auxtrophie la c'est un peu particulier, mais je pense pas qu'en dehors des personnes travaillant spécifiquement sur ce genes, qui que ce soit s'amuse a inactiver un gene par mutation ponctuelle alors qu'il est si facile de le déléter entierement.

YOyo

[invite9e6bc039]

comme chez coli je suppose, Mais avec des marqueurs d'auxotrophie (et pas de résistance). aprés tu fais peu faire des miniprep comme avec coli pour chercher le bon clone.

bon j'ai jamais fais, mais j'imagine que c'est faisable, juste a mon sens plus chiant que de tout faire chez coli et ensuite de transformer la levure avec le ton plasmide

Sinon c'est vrai que la mutagénèse dirigé se fait par PCR. Coli n'étant là que pour amplifier ton ADN et n'intervenant à aucun moment dans la mutation. Ceci dit c'est un peu jouer sur les mots.

Nan nan, ca passe PAS par Coli, tu fais une PCR en condition mutagenique (la Taq aura tendance a incorporer des dNTP qui "match" pas) que tu transforme directement dans la levure ==> integration au locus par recombinaison homologue, et tu selectionnes directement les clones qui t'interessent. Ca peut etre un phenotype-rescue ou un poil plus complique (les levuristes sont plein d'imagination )
C'est une technique classique chez cerevisae qui a permis de generer bon nombre de mutations ponctuelles tres interessantes.

[invite9e6bc039]

Oui en effet c'est jouer sur les mots vu que le criblage se fait chez coli!

Quant a la levure, je n'en vois pas l'interet recuperer un palsmide dans la levure est mille fois plus chiant que de le faire chez coli. Si c'est pour utiliser la capacité de la levure a recombiner alors on fait de la delétion par PCR en effet, mais la on n'est plus dans le cadre de la question initiale...

Enfin bref j'ai jamais vu aucun protocole de mutagenese dirigée utilisant la levure plutot que coli! Biensur si il s'agit de muter un gene d'auxtrophie la c'est un peu particulier, mais je pense pas qu'en dehors des personnes travaillant spécifiquement sur ce genes, qui que ce soit s'amuse a inactiver un gene par mutation ponctuelle alors qu'il est si facile de le déléter entierement.

YOyo

Y'a pas de plasmide.

Tu ne vois pas l'interet du systeme, tu ne "design" pas la mutation ponctuelle, tu en generes des milliers de manieres aleatoires et tu selectionnes celle qui porte un interet sur ton gene (c'est d'ailleurs inimaginable de les generer une par une sur plasmide au hasard )

[invite9e6bc039]

Enfin bref, c'est de la mutagenese dirigee, et tu n'utilises pas Coli, quoi

[invite9e6bc039]

De la meme maniere tu peux faire ta PCR avec des oligo qui portent la mutation ponctuelle que tu desires et transformer directement tes levures. A aucun moment tu te sers d'un plasmide.

[invite481f0dd7]

merci pour toutes ces réponses!!!!
en effet j aimerai autant ne pas passer par coli mais plutot si c'est possble, amplifier spécifiquement la partie que je souhaite avec des oligos portant des mutations (mais vu que ce n'est pas aux extrémités il va falloir que je procède en 2 étapes et après utiliser la méthode d'overlap.
Mon problème est ensuite pour la sélection des recombinants (recombinaison homologue), je pense intégrer le marqueur kanamycine et ensuite faire la recombinaison homologue ( comme pour une déletion d'un gène mais en remplacant cette fois avec la partie que je souhaite muter.
ca paraît faisable non?

[invite9e6bc039]

Si tu as un phénotype, c'est trivial.
Sinon, je pense que le plus simple est le "pop-in pop-out", ça marche très bien; par contre dans ce cas, ça passe par un plasmide, donc par Coli.

Les 2 solutions sont schématisées ici:

http://www-ermm.cbcu.cam.ac.uk/03006112a.pdf

Bonne chance

[invite481f0dd7]

merci
mais dans tes figures ca passe par un plasmide
la recombinaison homologue est possible meme si je balance seulement les fragments d'adn que je faire rentrer?
ce qe je veux faire c'est mettre le gene avec des mutations ponctuelles (mutagénèse dirigée) , auquel sera accolé le gène de la kanamycine (pour pouvoir sélectionner es recombinants) ; et en 5' et en 3' j aurai des séquences dentiques à celle du génome de façon à ce que le remplacement d gène soit bien spécifique.
je ne sais pas si j ai ete vraiment clair...

[invite9e6bc039]

La solution b correspond a ta strategie, et elle se fait sans plasmide, seulement avec 2 tours de PCR.
Dans leur cas c'est un YAC, dans le tient, c'est un chromosome endogène, c'est la seule différence.
Tu as besoin du marqueur URA pour sélectionner son excision qui donne une résistance au 5-FOA.

[invite481f0dd7]

ok merci!
et est ce que tu aurais par hasard la séquence des primer qu'il faudrait que j 'utilise pour amplifier ura3 a partir d'un prs306?
merci
et sinon la sélection au 5'FOA c'est pas trop chiant à faire?

[invite9e6bc039]

Désolé pour la séquence, la levure ça fait 2 ans que j'en fait plus

La sélection au 5-FOA est très simple.
Le composé lui-même est un peu cher, il me semble...

Ura+ ==> 5-FOA sensible
Ura- ==> 5-FOA résistante

Donc tu peux sélectionner positivement l'excision du locus URA3...

[Yoyo]

Y'a pas de plasmide.

Tu ne vois pas l'interet du systeme, tu ne "design" pas la mutation ponctuelle, tu en generes des milliers de manieres aleatoires et tu selectionnes celle qui porte un interet sur ton gene (c'est d'ailleurs inimaginable de les generer une par une sur plasmide au hasard )

Je tiens quand meme a préciser que je travaille sur la levure pour eviter tout malentendu donc les techniques de bio mol je connais

Ce dont tu parles est en effet interessant mais c'est de la mutagenese aleaoire et pas de la mutagenese dirigée ou tu ne cibles qu'une modification tres précise du gene.

Ensuite pour la recombinaison faut que ta souche dispose des marqueurs d'auxotrophies necessaire pour sélectionner l'integration ce qui n'est pas evident! (en tout cas il faut la construire). Enfin si tu as un phenotype tu peux t'en servir pour cribler (mais pas pour selectionner) mais tu ne choisiras pas la mutation.
Enfin il ne faut pas perdre de vue que la taq peut etre amenée a faire des erreurs (en presence de manganese notamment) mais qu'il existe toujours un biais aux niveaux des nt incorporés.

Enfin bref on s'éloigne de la question initiale qui etait de faire de la mutagenese dirigée sur 2 positions simultanées. En plus dans ce cas autant le faire sur un palsmide ca te permet de récuperer les mutants pour en faire ce que tu veux par la suite.

Yoyo

[invite9e6bc039]

Regarde mon lien sur le popin pop out, la solution b, c'est pas aleatoire, c'est au locus et basé sur la selection de l'excision du marqueur URA.

Je répète, c'est de la mutagénèse dirigée (tu design toi-même la mutation) sans utilisation de plasmide.

[invite481f0dd7]

c est sur que le mieux serait de passer par un plasmide mais bon... mon stage finit dans 1mois 1/2 alors j aimerai aller au plus vite.
je pense utiliser la méthode d'overlap pour les deux mutations mais le problème c'est que je me retrouverai avec des oligos de 75 nucléotides...
et puis j insererai une cassette kana comme marqueur de recombinaison.
L'atout de la méthode de site replacement était que les seuls changements étaient les mutations voulues alors que la je dois couper dans le génome ect...
Mais d'apres des levuristes la sélection au 5'FOA est vraiment tres chiante et difficilement utilisable dans ce cas.
je devrai donc me contenter d'a peu pres sauf si quelqu'un a une autre technique a me proposer?

[Yoyo]

Regarde mon lien sur le popin pop out, la solution b, c'est pas aleatoire, c'est au locus et basé sur la selection de l'excision du marqueur URA.

Je répète, c'est de la mutagénèse dirigée (tu design toi-même la mutation) sans utilisation de plasmide.

Mais ca n'est pas ce dont tu parlais dans ton message #11 ou tu parles d'insertion aleatoire du aux erreurs de la TAQ et ca tu peux pas choisir le lieu ou l'erreur se produira.
Et sinon dans ton schema b tu obtiens comment ton fragment possédant la mutation au centre?

Mais d'apres des levuristes la sélection au 5'FOA est vraiment tres chiante et difficilement utilisable dans ce cas.
je devrai donc me contenter d'a peu pres sauf si quelqu'un a une autre technique a me proposer?

c'est vrai que parfois c'est chiant, mais ca marche plutot bien. Sinon le gros probleme est que tu ne peux pas selectionner directement ta transfo sur 5FOA car rien ne va pousser! Il faut d'abord laisser pousser les clones puis faire des repliques sur 5FOA pour trouver les cellules qui y seront resistantes.

C'est clair que si il te reste 1 mois et demi c'est chaud... mais c'est vrai quelquesoit la methode que tu choisis. Je doute que tu aies le temps d'analyser tes phenotypes par la suite! sans compter que tu as probablement un rapport a ecrire!
Yoyo

[invite9e6bc039]

Mais ca n'est pas ce dont tu parlais dans ton message #11 ou tu parles d'insertion aleatoire du aux erreurs de la TAQ et ca tu peux pas choisir le lieu ou l'erreur se produira.
Et sinon dans ton schema b tu obtiens comment ton fragment possédant la mutation au centre?

Ben tu transformes avec une version mutée (un produit de PCR en fait) et tusélectionnes l'excision de URA3 au 5-FOA.

[Yoyo]

Ben tu transformes avec une version mutée (un produit de PCR en fait) et tusélectionnes l'excision de URA3 au 5-FOA.

OK j'ai bien compris mais tu l'obtients comment ton fragment PCR muté? vu que la mutation se situe dans le gene et qu'elle ne peut donc pas etre insérée par les oligos utilisés pour la PCR je ne vois pas comment tu peux faire.

ensuite je te rappelle que tu ne peux pas selectionner sur 5FOA directement a la sortie d'une transfo.

Yoyo

[invite9e6bc039]

AVec des oligos chevauchants, ou sinon en 2 tours.

Pour la sélection je vois pas le problème, tu laisse pousser un peu et tu fais des répliques.

[Yoyo]

AVec des oligos chevauchants, ou sinon en 2 tours.

C'est bien ce que je pensais, franchement le gain de temps avec la technique de muta dirigée sur plasmide me semble vriment minime (si gain de temps il y a).

Pour la sélection je vois pas le problème, tu laisse pousser un peu et tu fais des répliques.

Oui tu es obligé de passer par des repliques, pas moyen de sélection directe...

Mais en fait tout dépend vraiment a quoi est destiné ton mutant.

Yoyo