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pb de mutagenèse dirigée



  1. #1
    hulkinette

    Exclamation pb de mutagenèse dirigée


    ------

    bonjour à tous !
    je suis en stage et j'essaye de faire de la mutagenèse dirigée grâce au kit de stratagène " QuickChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit". je sais que la taille maximale du plasmide à utiliser pour ce kit est de 14 Kb et je travaille à partir d'un plasmide de 13.4 Kb, mais je pense pas que cela explique entièrement mes échecs !!
    quelqu'un a -t-il déjà utiliser ce kit et si oui, a-t-il déjà eu des difficultés?
    merci de m'aider !! :sos
    à bientôt.

    -----

  2. Publicité
  3. #2
    jmbowie

    Re : pb de mutagenèse dirigée

    Citation Envoyé par hulkinette Voir le message
    bonjour à tous !
    je suis en stage et j'essaye de faire de la mutagenèse dirigée grâce au kit de stratagène " QuickChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit". je sais que la taille maximale du plasmide à utiliser pour ce kit est de 14 Kb et je travaille à partir d'un plasmide de 13.4 Kb, mais je pense pas que cela explique entièrement mes échecs !!
    quelqu'un a -t-il déjà utiliser ce kit et si oui, a-t-il déjà eu des difficultés?
    merci de m'aider !! :sos
    à bientôt.
    J'ai déjà failli l'utiliser. Avec quel plasmide travailles-tu? Es-tu sûr que l'amorce s'accroche bien dessus? Le plasmide est-il bien dénaturé?
    Blast up your life!

  4. #3
    hulkinette

    Re : pb de mutagenèse dirigée

    je travaille avec un plasmide type pcDNA3 de 4.5 Kb dans lequel g mis l'ADNc du gène du facteur Willebrand (8.9 Kb). l'amorce que j'utilise fait 30 b avec 15 bases de chaque coté de la mutation et elle a été commandée sur le site recommandé par Stratagene, donc je pense pas qu'il y ait un problème à ce niveau.
    pourquoi le plasmide devrait être dénaturé? il l'est lors de la PCR mais pas avant, normalement le kit marche sur de l'ADN double brin .
    merci de m'aider. à+

  5. #4
    jmbowie

    Re : pb de mutagenèse dirigée

    Citation Envoyé par hulkinette Voir le message
    je travaille avec un plasmide type pcDNA3 de 4.5 Kb dans lequel g mis l'ADNc du gène du facteur Willebrand (8.9 Kb). l'amorce que j'utilise fait 30 b avec 15 bases de chaque coté de la mutation et elle a été commandée sur le site recommandé par Stratagene, donc je pense pas qu'il y ait un problème à ce niveau.
    pourquoi le plasmide devrait être dénaturé? il l'est lors de la PCR mais pas avant, normalement le kit marche sur de l'ADN double brin .
    merci de m'aider. à+
    Le gène de ce plasmide (bla), tu as la séquence? Il faut vérifier que ton amorce de mutagénèse s'apparie bien sur ce plasmide.
    Quel est ton problème au final (absence de transformants, pas de clones positifs en séquence, PCR qui ne fonctionne pas, etc.) ?
    Blast up your life!

  6. #5
    hulkinette

    Re : pb de mutagenèse dirigée

    l'amorce a été dessinée pour bien s'hybrider, il n'y a pas de problème possible à ce niveau (enfin j'espère pas).
    mon problème est que je n'obtient pas de colonies avec mon plasmide recombiné, les témoins de mutagenèse et de transformation sont OK, j'ai bien des colonies bleues et blanches. mais les bactéries traitées avec mon plasmide ne poussent pas sur le milieu de culture LB+ampicilline quelque soit la quantité d'ADN ou de solution bactérienne étallée.
    soit le problème est au niveau de la PCR , soit au niveau de la transformation. mais alors pourquoi les témoins marchent et pas mon plasmide?
    j'ai du mal à comprendre.

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Yoyo

    Re : pb de mutagenèse dirigée

    Salut

    j'utilise classiquement ce kit qui marche super bien. A condition que la PCR ait eut un bon rendement... et la parfois c'est la grosse galere surtout avec la pfu ultra...
    Mon conseil est de modifier tes cycles de PCR pour améliorer ton amplification (je fais classiquement au moins 25 cycles). et il m'est arrivé de remplacer la pfu par la phusion de chez (Finzyme) qui amplifie 1kb en 15s! ce qui est appréciable pour les gros plasmides.
    dernier conseil essaye la PCR avec une gamme de concentration de ton plasmide pour trouver la meilleur concentration.

    YOyo

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  10. #7
    hulkinette

    Re : pb de mutagenèse dirigée

    je confirme que ça peut être une grosse galère.
    en ce qui concerne l'enzyme, je ne pense pas pouvoir changer, mais si j'augmente le nombre de cycle ( X18 pour l'instant comme conseillé dans le protocole) ou le temps d'élongation (déjà à 7 minutes) peut-être que ça reviendrait au même, non?
    j'ai essayé avec 10, 25, 50 et 100 ng de plasmide, tu penses que je dois augmenter la quantité?

  11. #8
    Yoyo

    Re : pb de mutagenèse dirigée

    Salut

    Oui moi j'augmenterai le nombre de cycle sans hésitation.
    POur les quantités, tu parts de quoi? d'une miniprep? si c'est le cas oui j'essayerai un peu plus (mais pas trop sinon tu vas galérer avec la DpnI)

    Yoyo

  12. #9
    hulkinette

    Re : pb de mutagenèse dirigée

    oui, je part d'une miniprep.
    je vais faire d'autres essais avec des quantités d'ADN plasmidique de 25 à 125 ng par ex?
    merci pour tes precieux conseils !

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