Petite question sur le Western Blot

[invitef9400402]

Bonjour,

Je fais des WB en ce moment et une personne du labo m'a mis des doutes car elle ne comprends pas que je normalise la quantité de protéines que je dépose sur mon gel.
Son raisonnement est le suivant:
Si on veut connaitre l'effet d'un produit sur l'expression d'une protéine A.
Soit une cellule 1 contenant, je dis n'importe quoi mais peu importe, 100 % de protéine A soit 1 ug de notre proteine A d'interêt.
Une autre cellule traitée avec notre produit contient 1ug de notre protéine A d'interêt mais aussi, 3 ug de protéines B car notre composé a boosté la synthèse d'une protéine B.
Quand je vais déposer mes protéines sur le gel pour le WB, si je dépose 1 ug de matériel de ma première cellule, je déposerai en fait 1 ug de ma protéine A d'interêt.
Si je dépose la même quantité de protéines issue de ma cellule 2, c'est à dire 1 ug, je dépose seulement 0,25 ug de protéine A.
Quand j'aurai le résulat de mon WB, je me dirais que mon composé testé à diminué la synthèse de ma protéine A d'interêt...alors qu'en fait ce n'est pas le cas, le composé a favorisé la synthèse d'une autre protéine.

J'espère que c'est clair...mais c'est compliqué à expliquer

J'attends votre aide, si vous avez compris la problématique...
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[Yoyo]

Salut

Le probleme est que le raisonement repose sur une enorme approximation de départ (que la protéine surexprimée va avoir un impacte significatif sur la quantité de protéines). Or ce n'est jamais le cas, les variations d'expression d'une proteine ne seront jamais suffisantes pour avoir un impacte sur la quantification. Autrement dit ca sera toujours marginale par rapport a toutes les autres protéines qui elles ne sont pas influencées par ton produit.

Sinon un petit commentaire, pour normaliser correctement tu es obligé de prendre un temoin interne dans tes western (genre l'actine assez classiquement utilisée) pour etre sur que le transfert sur la membrane a été homogène etc...

YOyo

[Vinc]

Bonjour!
Cette question est intéressante mais j'ai deux remarques.
Dans ton exemple tu sous entends en fait que la protéine B dont l'expression a été boosté représente la majorité de la quantité de protéine que tu déposes sur ton gel ce qui me parait un peu abusif. J'ai tendance à penser que même si cette expression augmente, elle reste marginale devant la quantité de protéine totale et donc la quantité de protéine totale n'est pas affecté par l'augmentation de protéine B car sa valeur est tout à fait négligeable.


D'autre part lorsque tu feras ta normalisation en western tu la feras sur une 3 ème protéine C indépendante de A et de B, et à priori le niveau de C reste constant (c'est le principe d'une protéine de normalisation). Donc en faisant le ration A/C tu devrais avoir une vision réelle de l'effet de ta drogue.
Maintenant si on prend le cas où c'est justement sur la protéine B que tu normalise la protéine A (imaginons que l'actine bouge, comme cela arrive dans certains lignées), tu vas voir une augmentation de B seule et c'est un résultat en soit : ta protéine de normalisation est modulée par ta drogue. Après il faut voir si ce résultat t'intéresse ou pas. Mais tu dois par contre normaliser ta protéine A sur une autre protéine dont l'expression ne change pas.


V.

EDIT : croisement avec Yoyo

[invitef9400402]

ça me paraît clair maintenant
Merci pour vos réponses!

[A voir en vidéo sur Futura]