Immunoprécipitation

[inviteb32d9450]

Bonjour,

Comme vous l'aurez compris j'ai un petit problème pour immunoprécipiter ma protéine...
En gros, j'arrive a sortir une petite bande sur mon western-blot mais ça représente un fifrelin. J'ai essayé divers tampons de lyse mais j'évite tout de même avec détergent ionique car le but final est de mettre en évidence des partenaires de cette protéine!
Ma protéine est nucléaire et sous forme insoluble associée à la chromatine, et je me dis que le probléme doit certainement venir de là! Devrais-je faire un petit traitement à la DNase1 pendant la lyse? peut être tenter un détergent ionique? ou encore sonicer?

Merci pour votre aide!
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[piwi]

La fraction insoluble chromatinienne se résoud à grand coup d'ultracentri normalement.
Quelle est la quantité de cellules que vous lysez? Quelle volume a votre fraction insoluble chromatinienne et combien déposez vous sur votre WB?

Cordialement,
piwi

[inviteb32d9450]

Je fais mes IP sur 1,5mg par échantillon (ma protéine n'étant pas trés abondante) donc environ 7 millions de celllules par puit lors du WB. Cela dit après avoir lysé mes cellules (tampon salin ou NP-40 pendant 30 min) je centrifuge le lysat et ne fait mon IP que sur le surnageant...

[piwi]

C'est peu. C'est peut être pour cela que vous avez du mal à la voir. Essayez de précipiter un peu plus de matériel.

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteb32d9450]

J'ai deja essayer c'est comme si ca saturait...
Je pense qu'il faudrait trouver un moyen de dissocier la protéine de la chromatine avant l'incubation avec l'anticorps, non?
En tout cas merci de votre aide

[piwi]

Normalement avec les ultra centrifugations dans un tampon salin la protéine devrait se détacher. La question n'est normalement pas là.
Vous dites que ça sature. Qu'est ce qui saturerait? Les billes?
Sinon, vous mettez combien dans votre WB? Parce que trop de protéines tue le WB.

[invite71f23525]

Pour voir si l'étape d'incubation avec les billes de protéine A-Sépharose est efficace, après avoir incuber vos extraits et centrifuger, vous pouvez réaliser un WB sur les billes comme vous le faites actuellement, et en plus un WB sur le surnageant. Le WB sur le surnageant sera donc représentatif des protéines qui ne se sont pas liées aux billes.

La protéine d'intérêt est-elle taggée? L'anticorps utilisé pour l'IP est -il dirigé contre une étiquette? Avez-vous essayé un WB sur le culot de billes après IP en procédant à une étape de dénaturation pour être sûr de dissocier la protéine des billes (parfois des anticorps se lie très fortement, dans ce cas il faut peut-être changer d'anticorps pour rester dans des conditions natives, ou alors tester avec des concentrations salines plus importantes)?

Greg