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Dessin de Primer pour qPCR - BLAST



  1. #1
    OlavH

    Question Dessin de Primer pour qPCR - BLAST

    Salut,

    ça fait pas mal de temps que je dessine des primers pour la qPCR, et bien sur pour vérifier leur spécificité je fait un BLAST. Depuis peu apparait un fameux "misc_RNA" en occurence...

    De quoi cela s'agit il?
    En fouillant un peu, il me semble que cela correspond à des RNA non codants...

    1-Quelqu'un peut confirmer?
    2-Faut il en tenir compte pour le design?


    Merci d'avance!!

    Tchao

    -----


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  3. #2
    MaliciaR

    Re : Dessin de Primer pour qPCR - BLAST

    Salut,

    Peux-tu préciser ce que tu fais et avec quel logiciel? Parce que j'ai regardé rapidos ici en affichant les paramètres avancés aussi et je ne vois pas de misc_RNA...
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  4. #3
    OlavH

    Re : Dessin de Primer pour qPCR - BLAST

    Hello, c'est bien ce que j'ai utilisé...mais pour déssiner mes primers...! pas pour blaster!

    En effet le lien que tu parle permet de dessiner des primers à partir d'une séquence que tu donne, mais en général, je vérifie toujours les couples qu'il me donne en faisant un Blast par la suite(blastn pour etre précis). Et c'est là qu'apparait le fameux misc_RNA dans certaines occurences...

    merci encore

  5. #4
    MaliciaR

    Re : Dessin de Primer pour qPCR - BLAST

    Salut,

    Pour t'avouer, je ne comprends pas trop ce que tu fais. Primer-BLAST a été créé pour designer des primers ET les blaster :
    Primer-BLAST was developed at NCBI to help users make primers that are specific
    to the input PCR template. It uses Primer3 to design PCR primers and
    then submits them to BLAST search against user-selected database. The blast
    results are then automatically analyzed to avoid primer pairs that can cause
    amplification of targets other than the input template.
    (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/pr...rimerinfo.html)
    Je ne comprends pas contre quelle banque tu indexes tes primers avec blastn. Ce dernier n'est pas fait pour ça...
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  6. #5
    piwi

    Re : Dessin de Primer pour qPCR - BLAST

    Je me suis posé exactement la même question. J'ai l'impression que votre démarche n'est pas optimale.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    OlavH

    Re : Dessin de Primer pour qPCR - BLAST

    Euhh....Je pense bien au contraire que vous faites trop confiance à cette application. Sachez qu'elle est basée sur Primer3, et qu'elle fait un Blast un fois qu'elle donne les couples d'oligos. Seul certaines occurences sont données, notament celle qui ont un très petite e-value.

    Cependant, si vous avez la curiosité de faire un "Vrai" blast avec les oligos donnés, et bien ce n'est plus tout à fait la même chose...et vous pouvez remarquer qu'on vous donne aussi des mRNA de "Predicted Protein", et le fameux "Misc_RNA" dont je vous parlais....

    Et concernant le type de banque que j'utilise, et bien j'utilise celle du ganome + transcriptome humain. (blastn --> http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Bl...SEARCH_NAME=bn)


    Je préfère prendre plus de précautions que nécessaires in silico pour éviter de commander des couples qui donneront des produits aspécifiques par la suite!

    J'espère que mon message est clair, sinon je me ferais un plaisir de vous détailler ma démarche.

    Cordialement,

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  10. #7
    MaliciaR

    Re : Dessin de Primer pour qPCR - BLAST

    Citation Envoyé par OlavH Voir le message
    Euhh....Je pense bien au contraire que vous faites trop confiance à cette application. Sachez qu'elle est basée sur Primer3, et qu'elle fait un Blast un fois qu'elle donne les couples d'oligos. Seul certaines occurences sont données, notament celle qui ont un très petite e-value.

    Cependant, si vous avez la curiosité de faire un "Vrai" blast avec les oligos donnés, et bien ce n'est plus tout à fait la même chose...et vous pouvez remarquer qu'on vous donne aussi des mRNA de "Predicted Protein", et le fameux "Misc_RNA" dont je vous parlais....
    Je suis désolée de te contredire mais tu fais exactement ce que les bioinformaticiens derrière Primer-BLAST ont voulu faire éviter : l'utilisation de blastn lors de la création de primers.
    Donc, je préfère faire confiance à une application spécialement conçue pour ce que je veux (ie, création de primers dans le cas ici). Ce n'est pas un manque de curiosité, mais une chose différente : j'utilise les outils pour faire les choses pour lesquelles ils sont développés (ou je fais mon mieux pour développer les miens )

    Concernant les "Predicted proteins"... Pour m'avoir tapé la tête contre un mûr pour l'annotation de divers génomes et regarder du côté des métagénomes actuellement, je préfère vraiment prendre des pincettes pour ces super résultats... Concernant les e-values : ce n'est pas un score de similarité, c'est juste une indication de la significativité statistique de ton résultat.

    Après, chacun fait comme il veut. En connaissance de cause
    Dernière modification par MaliciaR ; 15/01/2009 à 23h43.
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  11. #8
    OlavH

    Re : Dessin de Primer pour qPCR - BLAST

    oui c'est vrai après tout, adoptons la démarche que nous désirons...

    Cependant, cela ne répond toujours pas à la réponse initiale : qu'est ce que le misc_RNA !!!!


    Tchao!

  12. #9
    piwi

    Re : Dessin de Primer pour qPCR - BLAST

    Je crois que l'intérêt d'utiliser le bon outil est qu'il est designé pour. BLAST est un programme paramétrable. Afin d'en simplifier l'utilisation par les personnes non versées dans l'informatique il existe plusieurs interfaces disponibles préparamétrées. C'est à dire que des personnes ont réfléchi aux réglages les plus pertinants pour arriver le plus souvent au but qu'ils se sont fixer. La conséquence est que sortir des clous de ces objectifs entraine une perte d'efficience.

    Sinon misc c'est pour miscellaneous qui signifie une incertitude. On a identifié un ARN mais ça fonction et même plus loin, sa réalité biologique, reste incertaine.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  13. #10
    OlavH

    Re : Dessin de Primer pour qPCR - BLAST

    ok, merci, et concernant le traitement de cette information?

    dois je si jamais on me dit que mes primers alignent avec un "misc_RNA" dois je prendre en compte que cela me donnera un produit aspécifique ou bien non?

  14. #11
    piwi

    Re : Dessin de Primer pour qPCR - BLAST

    Il n'y a rien de marqué dans le marbre. C'est vous qui jugez.
    Les oligos ne coutent pas cher du tout. Personnellement, pour vous donner un exemple de démarche, je commande toujours deux paires d'oligos. Et si je devais rencontrer ce misc-RNA je n'en tiendrais pas compte.
    Maintenant, it's up to you
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

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