Détergent pour cellule humaine

[inviteedc22d93]

Bonjour,
je suis confrontée à un problème : je travaille sur l'expression d'une proteine virale dans des cellules humaines que je ne parviens pas à solubiliser après extraction des protéines cellulaires. Un protocole est déjà au point pour l'expression chez la bactérie et la levure et cette étape de solubilisation permettant d'extraire la protéine des membranes fonctionne et pour cela nous utilisons du Chaps.
Je souhaiterai donc utiliser un autre type de détergent qui serait plus efficace pour les cellules humaines. Cependant je ne trouve aucunes données précises sur le net ou ncbi, quelqu'un en connaitrait-il un? merci d'avance!
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[inviteedc22d93]

Personne pour m'aider?!

[Vinc]

Bonjour!
Que voulez-vous faire avec cette protéine ensuite?

V.

[inviteedc22d93]

Bonjour, merci de m'avoir répondu!
Le but est d'obtenir suffisamment de protéine pour la voir en gel de coomassie et faire une étude de spectrométrie de masse par la suite. Je n'en ai donc pas besoin de beaucoup!

[A voir en vidéo sur Futura]

[Vinc]

Bonjour, merci de m'avoir répondu!
Le but est d'obtenir suffisamment de protéine pour la voir en gel de coomassie et faire une étude de spectrométrie de masse par la suite. Je n'en ai donc pas besoin de beaucoup!

Heu... si quand même...
Si vous voulez passer en spectro de masse et voir votre protéine en coomassie il va falloir charger le gel un minimum.
Je pense que vous pouvez travailler en Laemmli mais je ne fais pas de mass spec donc peut-être n'est ce pas compatible avec ce que vous souhaitez faire par la suite.
Sinon on peut utiliser un très large panel de buffers dénaturants à base de Guanidium, Urée, Triton etc...

V.

[invite52946466]

Bonjour,
Quel type de cellules?
Adhérentes ?

[inviteedc22d93]

Bonjour, et merci pour vos réponse!
ce sont des cellules HeLa qui sont adhérentes, pour répondre à vinc j'ai déjà essayé le laemli qui est compatible avec la spectro mais la solubilisation est mauvaise! Je me demande plutot s'il y a des détergents vraiment spécifiques des cellules humaines?

[piwi]

J'ai un peu du mal à cerner exactement le sens de votre question. Ce qui fait d'une cellule un cellule "humaine" c'est le matériel génétique qu'elle porte. En dehors de cela sa structure et son organisation ne diffère en rien d'une autre cellule animale.

Peut être qu'en augmentant le SDS dans le leamelli à 0.2 ou 0.3% (au lieu des 0.1% habituels) et en faisant bouillir plus longtemps, vous parviendriez à extraire vos protéines des membranes.

Cordialement,
piwi

[invite52946466]

peut etre moyen de substituer le beta-mercaptoethanol par dithiotreitol (DTT) env. 10 mM final dans le Laemmli......

[inviteedc22d93]

Il y a déjà du DTT dans mon tampon de laemmli mais je vais essayer d'augmenter le pourcentage de SDS et voir si ça fonctionne

[Vinc]

J'ai un peu du mal à cerner exactement le sens de votre question. Ce qui fait d'une cellule un cellule "humaine" c'est le matériel génétique qu'elle porte. En dehors de cela sa structure et son organisation ne diffère en rien d'une autre cellule animale.

Je pense que la question était surtout : est ce qu'un protocole pour levure ou bactérie fonctionne en cellule mammifère? non?

peut etre moyen de substituer le beta-mercaptoethanol par dithiotreitol (DTT) env. 10 mM final dans le Laemmli

Plutôt 100mM final... Et le beta mercapto a exactement le même mode d'action que le DTT.

V.