Bonjour à tous,
J'utilise la technique du western blot afin de quantifier mes protéines d'intérêt (par chemiluminescence, révélation par l'ECL+ et analyseur d'image permettant de quantifier mes blots), mais une question se pose à moi: pourquoi dit-on du western blot que c'est une technique "semi-quantitative"? Quelles sont les limites de la quantification?
Merci pour vos réponses et je m'excuse d'avance si j'ai fait un doublon .
Semi quantitative car vous quantifiez en fait un ratio établi par rapport à une référence.
Elle serait quantitative si vous déposiez une gamme de concentration de la protéine que vous souhaitez quantifier. En général ce que l'on fait c'est que l'on utilise une protéine standard (l'actine) et on dilue les échantillons pour avoir la même quantité dans tous les puits. On streap la membrane et on effectue un immunomarquage de la protéine d'intérêt. Vous ne savez pas combien vous avez de protéine dans l'absolu. Mais le rapport prot d'intérêt/actine dans chacune des puits vous permet de dire qu'il y en a plus là que là. C'est relative ou encore semi quantitatif.
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
J'ajouterai en outre, que pour être quantitatif, il faudrait faire systématiquement un gamme standard afin de s'assurer que l'on est dans la zone linéaire de l'ensemble du process {transfert, incubation I, incubation II, chimiluminescence, exposition sur film}. En effet, à titre d'exemple, s'il y a trop peu d'anticorps, si le film est saturé, si tout le réactif de chimiluminescence est utilisé avant la fin de l'expo, etc... les différences entre les intensités ne représenteront plus la réalité, l'analyse ne sera plus quantitative. Ne pas oublier non plus l'influence des réglages de la caméra, du bining, etc... sur l'acquisition des images, et donc le traitement.
Ensuite, quand on fait une quantification par rapport à une référence, si on utilise des anticorps avec des affinités trop différentes pour leur cible, c'est comme pour la PCR quantitative relative, on introduit un biais : un différence entre 2 quantités visible avec un anticorps risque de ne pas l'être avec le 2ème anticorps (surtout si on utilise des expositions sur des films distincts pour les 2 anticorps, avec des temps d'exposition différents, etc...).
Puisque l'on est dans les critiques je vais quand même sortir du bois en disant que je n'ai jamais vraiment cru à la possibilité de faire une quantification intéressante en WB.
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Il est possible en western blot d'observer des variations de quantité de protéines, mais il faut être prudent pour éviter les biais méthodologiques; par exemple quand j'en faisais, j'utilisais comme référence la quantification d'un de mes échantillons, le même tout au long de la manip, je déposais chaque échantillon en double avec 2 concentrations différentes (ce qui me permettait de vérifier la proportionnalité entre mes 2 dépôts; par exemple quand un échantillon était trop concentré cette proportionnalité n'était pas respectée. Je repassais alors l'échantillon en augmentant la dilution), chaque gel contenait des échantillons issus de mes différents groupes expérimentaux, .....
C'est contraignant, coûteux (surtout le fait de passer tous les échantillons en double et de "perdre" 2 puits pour l'échantillon de référence), mais contrairement à Piwi je pense que même si cette méthode reste semi quantitative et ne permet pas de quantifier des modifications mineures, lorsque le phénomène est suffisamment important (de mémoire dans une de mes manip: la phosphorylation d'une protéine augmentée de l'ordre de 50% chez les animaux soumis à un protocole particulier par rapport aux témoins), c'est une méthode satisfaisante.
