Sds-page

[inviteb1c4fe07]

Bonjour,

Ce matin j'ai passé mon exam de bioingénierie des prot et je n'ai pas su répondre à une question.
Pour purifier une protéine recombinante (AX2), Ils ont fait une chromatographie d'affinité avec du Nickel (car His-Tag), puis une SDS-PAGE. Je n’ai pas l'image du gel mais je peux vous présenter les résultats.
Alors c'est trois pistes:
Piste 1: Les marqueurs
Piste2 : Après élution avec du PBS et avant élution avec l'imidazole, ils ont obtenu une bande intense de 16.5KDa et qq bandes moins intenses de PM différents de 16.5 KDa.
Piste3 : Après élution avec l'imidazole une bande unique, intense légèrement supérieure à 16.5KDa qui correspond à la protéine d'intérêt (AX2)
La question c'était, expliquez les résultats de la piste 2 (à quoi correspond la bande de 16.5 KDa observée).

J'espère que ma question est claire si elle ne l'est pas n'hésitez pas à demander plus d'info.

Merci
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[invitea0443c8c]

Bonjour!
A priori la piste 2 correspond à la protéine endogène non taguée qui migre donc à 16,5 alors que dans la piste 3 la protéine taguée shift un petit peu au dessus de 16,5. Les bandes différentes de 16,5 dans la piste 2 peuvent être:
- pour les bandes supérieures à 16,5 kDa:
. léger décrochage de la protéine taguée par le PBS (avant l'imidazole)
. modifications post-traductionnelles éventuelles (phosphorylations, ubiquitination, sumoylation, farnésylation, palmitoylation, etc...)

- pour les bandes inférieures à 16,5 kDa:
. dégradation

Après tout dépend si cette purification a été faite dans des conditions natives ou pas. Dans le premier cas vous pouvez observer des complexes d'intéraction.

V.

[invitea0443c8c]

EDIT: c'est un SDS-PAGE donc dénaturant, vous ne verrez normalement pas de complexes...

V.

[inviteb1c4fe07]

Bonjour,

Désolée pour le retard mais il fallait que j'ai le corrigé pour mieux vous répondre.

Alors il y'a trois possibilités:
1. La bande de 16.5 KDa correspond à l'excès de la protéine càd que tous les sites sur la colonne étaient occupés.
2. Le peptide drapeau a été protéolysé vu sa petite taille et donc elle correspond à la protéine non taguée.
3. IL peut s'agir d'une protéine endogène ayant le même PM que la protéine d'intérêt.

Cordialement

[A voir en vidéo sur Futura]

[Zellus]

Salut,

C'est la réponse à ton exam les trois propositions là ? La 1 c'est pas possible vu que les protéines dans les puits 2 et 3 n'ont pas la même taille (à moins que c'était la même protéine qui c'est pas fixée et qui a été clivée après mais j'en doute). Les 2 et 3 ok même si c'est la 2 la plus plausible si la bande est vraiment intense.
Juste une précision : on ne parle pas d'élution normalement avec le PBS, c'est juste un lavage de la colonne pour enlever toutes les protéines non fixées.
Et les protéines de différentes tailles dans le puits 2 ça doit être tout simplement des protéines cellulaires qui ne se sont pas fixées et qui sont virées avec le PBS.

[inviteb1c4fe07]

Salut,

D'abord, c'est moi qui me suis trompée concernant le Pbs, effectivement c'est un lavage et non une élution.

Salut,

C'est la réponse à ton exam les trois propositions là ? La 1 c'est pas possible vu que les protéines dans les puits 2 et 3 n'ont pas la même taille (à moins que c'était la même protéine qui c'est pas fixée et qui a été clivée après mais j'en doute). Les 2 et 3 ok même si c'est la 2 la plus plausible si la bande est vraiment intense.

Et les protéines de différentes tailles dans le puits 2 ça doit être tout simplement des protéines cellulaires qui ne se sont pas fixées et qui sont virées avec le PBS.

Par contre là je ne suis pas d'accord avec toi, car la protéine de 16.5KDa en piste 2 a pratiquement le même PM que la protéine en piste 3 (la protéine n’est pas clivée) et les deux bandes ont la même intensité donc je ne vois pas pourquoi tu trouves ça impossible!!!
Pour la troisième je sais que c’est rare mais ça reste une possibilité.

[Zellus]

Par contre là je ne suis pas d'accord avec toi, car la protéine de 16.5KDa en piste 2 a pratiquement le même PM que la protéine en piste 3 (la protéine n’est pas clivée) et les deux bandes ont la même intensité donc je ne vois pas pourquoi tu trouves ça impossible!!!
Pour la troisième je sais que c’est rare mais ça reste une possibilité.

Pratiquement le même ce n'est pas la même chose que le même. S'il y a vraiment un décalage tu ne peux pas dire qu'il s'agit exactement de la même protéine. Le His tag n'est pas bien grand (< 1 kDa) alors il ne va pas y avoir un grand décalage dans le gel.
Si les protéines en pistes 1 et 2 avaient exactement la même taille alors là oui ce serait sans aucun doute ta colonne qui est saturée.

[inviteb1c4fe07]

Salut,

Justement c'est un tout petit décalage donc ça doit être la même protéine.
Merci

Cordialement

[Zellus]

Ben j'ai dit que tu avais un décalage assez faible aussi entre ta protéines protéines étiquetée et non étiquetée donc ça peut aussi être ça. Mais bon j'ai pas vu le gel donc je peux pas l'assurer non plus. Et puis si ton prof t'a donné cette correction c'est que ça doit être la même ^^.