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SDS page



  1. #1
    hedialmely

    SDS page

    Bonjour
    aprés extraction des protéines. je n'arrive ppas à obtenir des bandes sur mon gel polyacrilamides. même si je précipite mes protéines avec l'acétone. il faut noter qu'il y à smire (trajectoir) sur mon gel. est ce que quelqu'un peut m'aider

    merci

    -----


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  3. #2
    fxmulder

    Re : SDS page

    Bonjour,

    Alors, peux tu nous préciser un peu ton protocol ?
    Comment tu extrais tes protéines ? (A partir de cellules sur boites, avec un kit, avec un tampon (genre RIPA)).
    Dose tu tes protéines (Bradford, BCA) pour être sur que tu récupères bien des protéines ?
    Pourquoi précipites-tu tes protéines ? (Pas assez concentrée ?)
    Combien de protéines déposes-tu sur gel ?
    Quel type de gel ? (acrylamide 10% ?)
    Le smir tu l'observes en bleu de coomassie, argent ?
    Tes marqueurs protéiques migrent t'il bien ?

    Après ces réponses, je suis sûr qu'on pourra y voir plus clair.

    A bientôt.

    FX

  4. #3
    hedialmely

    Re : SDS page

    Bonjour

    Pour l'extraction j'ai utlilisé poudre délipidé du matériel végétale
    et pour les différents fractions protéiques j'ai utilisé quatre tampons
    eau pour les globulines, tris/HCl pour albumine, alcool 75% pour prolamine et acide acétique 2N pour les glutéilines

    Ensuite j'ai dosé avec méthode Bradford et courbe d'étallonage avec BSA

    Le gel utilisé est 3% pour concentration et 12% ou 10% pour séparation

    Pour le marqueur je n'est pas déposer, mais j'ai utiliser d'autre protéines d'autres collègues et qui ont montrer des bandes sur le gel

    Le smir observé c'est en bleu de coomassie

    Je précipite car j'ai pas trouvé de solution

    Merci.
    A bientôt

  5. #4
    mortabit

    Re : SDS page

    et tu déposes combien dans les puits?

  6. #5
    hedialmely

    Re : SDS page

    Bonjour.

    Je dépose au maximum 20ul.

    Merci.

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    zigzzag

    Re : SDS page

    et pourquoi tu n'a pas commencer deja par une extraction des protéines totales avec le tampon phosphate

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  10. #7
    hedialmely

    Re : SDS page

    Bonjour.
    Merci de m'indiquer comment je procède à l'extraction des protèines avec le tampon phosphate. Et quel est l'utilité?
    Merci.

  11. #8
    zigzzag

    Re : SDS page

    le tampon phosphate permet l'extraction des protéine totales d'une poudre vegetale, au moin tu sera sure de l'existance de votres protéines, en plus c'est un protocol trés simple

  12. #9
    hedialmely

    Re : SDS page

    Mais j'ai utiliser methode bradford qui m'a indiquer qu'il y a présence de protèines.
    en plus sur le gel il y a un smir (trajectoire de protèine).
    merci

  13. #10
    Zellus

    Re : SDS page

    Bonsoir,

    Juste pour préciser c'est "smear" et pas "smir(e)" et personnellement je traduit ça par "traînée", mais bon là n'est pas le problème ...
    Tu dis donc avoir une traînée () sur ton gel. As-tu essayé de déposer moins d'échantillon par puits ? Si oui, c'est toujours pareil ?
    Et quelle concentration de protéines as-tu trouvé en Bradford ?

  14. #11
    hedialmely

    Re : SDS page

    Bonjour,
    J'ai essayer de déposer différentes quantité de protéines dans les puits.
    Pour la quantité que j'ai déduis à a partir du dosage Bradford c'est 35ug/ul.

    Merci

  15. #12
    Yoyo

    Re : SDS page

    salut

    tu pourrais pas nous faire un scan de ton gel?
    ca serait plus simple
    Yoyo

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  17. #13
    Zellus

    Re : SDS page

    Salut,

    Pour la quantité que j'ai déduis à a partir du dosage Bradford c'est 35ug/ul
    C'est beaucoup ! Je pense que tu peux déposer beaucoup moins que 20 ul sur ton gel, genre 2 ul ... Mais peut-être as-tu déjà essayé ?

  18. #14
    zigzzag

    Re : SDS page

    personnelement, safais bien longtemp que j'ai fais sa et je me rapel que 12ul d'extrait protéique sa ma donner une meuilleur resultat

  19. #15
    Yoyo

    Re : SDS page

    Citation Envoyé par zigzzag Voir le message
    personnelement, safais bien longtemp que j'ai fais sa et je me rapel que 12ul d'extrait protéique sa ma donner une meuilleur resultat
    C'est pas tellement le volume qui compte mais la quantité de protéine. Je trouve aussi que c'est trop de protéine pour avoir une belle migration.

    YOyo

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