migration sds page

[invite6352a023]

bonjour à tous,

j'ai un souci pour mes wertern-blot. j'utilise des gels à 10% et je fais migrer à 100V environ 2h, enfin jusqu'à que mon front de migration soit OK. De plus, mes marqueurs de poids moléculaires (Broad Range de Bio-Rad) migrent aussi très bien. Mais à chaque fois mes échantillons ne migrent pas assez. Après coloration au rouge ponceau je constate que mes échantillons n'ont parcouru qu'un tiers du gel environ.
Comme mes marqueurs de tailles migrent correctement je ne vois pas de quoi ça pourrait venir mise à part de ma dénaturation de protéines, mais j'utilise le même protocole que mes collègues qui ne rencontrent pas ce problème.

Je voulais donc savoir si quelqu'un aurait une idée parce que là je recommence mes western-blot depuis un moment sans résultats positifs.

merci d'avance
julien
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[fxmulder]

Salut !

Tiens, tiens, ça me rappelle tout à fait les problèmes dont j'ai fait face très récemment. J'avais également des migrations très moches avec mes protéines, alors que les marqueurs migraient parfaitement. J'ai identifié mon problème : un lot d'acétone pourri (provenant d'une bouteille en plastique et non en verre) et la resuspension des protéines dans de l'urée 9M. La précipitation des protéines dans de l'acétone et la reprise dans de l'urée m'a toujours donné des résultats pourri, jusqu'à ce que je change de bouteille d'acétone. Depuis même, j'évite l'urée au maximum et j'utilise de préférence du laemmli. Depuis, aucun soucis.

Tu précipites tes protéines ? Tu les reprends dans quoi ? C'est des protéines de quelle provenance (Extraits nucléaires, humain, souris...) ?

FX

[invite6352a023]

merci fxmulder pour la réponse,

je fais une extraction de cytosol total sur des plaquettes sanguines et je les dénature en les faisant bouillir avec un tampon glycérol/SDS avant de les faire migrer.
Ce qui me semble bizarre c'est que les bandes ne sont pas tellement vilaines, c'est surtout que mes protéines donnent l'impression de rester bloquer au début du gel de séparation.

julien

[fxmulder]

Autre idée peut-être... Tu utilises un gel de stacking avant de migrer ? Est ce que tu as tout de même testé des anticorps sur des membranes ou tu as transféré ton gel ? Juste pour voir si la taille théorique de ta prot correspond plus ou moins à ce que tu observes.

Tu peux nous scanner une photo d'une de tes membranes en ponceau ?

FX

[A voir en vidéo sur Futura]

[Vinc]

Bonjour!
Petite quetsion, as tu finis complètement ton western ou t'arrêtes tu à chaque fois au ponceau? Si oui, il arrive fréquemment que les bas poids moléculaires soient moins visbles voir même absents au ponceau mais ca ne signifie pas qu'il n'y a pas de protéines. C'est une explication tirée par les cheveux mais c'est du vécu. Pour le vérifier tu peux éventuellement faire une coloration au bleu colloïdal.
Deuxième chose, la migration dans le gel de résolution donne une place très importante au pH de tes buffers donc mon conseil : reprends tes pH et refais tes tampons.
Troisième chose, vérifie le pourcentage de glycérol de ton tampon de charge.

Si tes protéines migrent effectivement plus lentement que tes marqueurs ce n'est pas un problème de montage électrique ( ou de voltage/ampérage) mais un problème au niveau du resolving ou d'un tampon de charge trop concentré en glycérol.

Bon courage!


V.

[invite6352a023]

Après la migration, je fais un transfert et je vérifie ensuite par du rouge ponceau la qualité de la migration et du transfert. Ensuite je fais une marquage anticorps. Le problème est donc que je ne fais pas de photo au ponceau, je le rince direct et je sature ma membrane pour la révélation.
Mon problème ici est surtout que je cherche à faire une détection avec un anticorps anti-phosphotyrosine et j'ai donc besoin d'avoir une bonne migration/séparation.

J'utilise effectivement un stacking, en ne mettant qu'un voltage constant de 100V pour le stacking et le séparation. j'ai eu fait dans un ancien labo deux voltage différent, 60V pour le stacking, 100V pour le séparation, mais je ne sais pas si ça aurait une influence dans mon cas

Pour ce qui est du tampon de charge, j'utilise le glycérol dans un pourcentage "normal" correspondant à d'autres protocole. Je vais essayer d'en faire moins concentré en glycérol car cette hypothèse me semble possible.

Merci en tout cas pour vos réponse je n'ai pas d'échantillons pour re-tester cette semaine mais c'est prévu pour le début de semaine prochaine, donc je verrais pour l'influence de la concentration en glycérol...

Si vous avez d'autres hypothèses je suis preneur car c'est une manip assez importante.

julien

[invite6352a023]

je viens de recommencer un gel en diminuant la concentration en glycérol, en prenant de nouveaux produits (acrylamide, tampons avec le bon pH, b-mercaptoéthanol...). La migration est un peu meilleur mais mes protéines ne dépassent toujours pas la moitié de mon gel de séparation alors que mes marqueurs et mon front de migration sont OK.

Je ne sais donc pas trop quel paramètre modifier pour la prochaine fois...?
si quelqu'un avait une idée je serai toujours preneur...

julien

[Vinc]

Salut!
Peux tu me détailler ton protocole STP:
- nombre de cellules
- tampon de lyse
- combien tu charges
- système de migration
- tout le reste....

Merci!

V.

[invite6352a023]

bonjour,

merci vinc pour la réponse.
alors voila, je prépare 60 millions de plaquettes (volume de 200-400µl). après traitement je fais une extraction du cytosol total grâce à un kit Active Motif. Ensuite je dénature 5µg de protéines (environ 10µl) par 5µl de tampon de charge (5min à 100°C). je fais ensuite migrer mes échantillons dans un gel 10% pendant environ 2h, grâce à une système Apelex (cuve + générateur). Après transfert sur membrane de nitrocellulose, je vérifie par du rouge ponceau et je fais la révélation le lendemain.

ce matin j'en ai refais migrer un, avec encore un nouveau tampon de charge, notamment avec du b-mercapto neuf alors je croise les doigts...

julien

[invitefef66bc2]

bonjour,
Je te conseille de transférer sur des membranes de PVDF préalablement "mouillée" dans du méthanol. La capacité de charge en protèïnes est plus importante (le double de la nitrocellulose).
Ainsi tu peux visualiser tes protéïnes sur la membrane juste en la retrempant dans le méthanol puis en transilluminant. Tu verras peut-être tes bas poids molec apparaître.
Sinon tu équilibres tes membranes avant le transfert? (en fait je n'ai pas compris si tu coloriais tes gels ou tes membranes car si c'est les membranes ça peut-être un problème de transfert).

[invite6352a023]

bonjour,

Ce que je fais c'est que je transfère sur la membrane et ensuite je ne travaille que sur la membrane.
Je commence par vérifier la qualité du transfert par une coloration rouge ponceau, et c'est là que je me rends compte de la qualité de la migration de mes protéines. Après le rouge ponceau je rince la membrane dans du PBS et je fais une immunorévélation de ma (mes) protéines d'intérêts.
Je pense que c'est surtout un défaut de migration. En utilisant un b-mercapto neuf pour mon tampon de charge j'ai eu hier une migration nettement plus efficace. Je pense que le problème c'est surtout la quantité de glycérol dans le tampon (merci Vinc) et le fait que les lot de b-mercapto que j'avais utilisés était plus très bon.

bref, c'est pas encore optimal mais c'est largement mieux, donc merci à ceux qui m'ont aidé.

[invitefe7ff779]

Bonjour,
je ne connais pas le kit d'extraction que tu utilises mais est ce que ça ne serais pas plutôt lui qui est pourri. Je veux dire, pour une raison ou une autre (trop vieux, pas bonnes conditions de stockage...) est ce que le pH des tampons de ton kit n'aurait pas varié, ou il n'y aurait-il pas eu précipitation ou concentration (du a une évaporation) en sel (je parle toujours des tampons)... bref, je ne sais pas, ce sont des hypothèses mais j'ai l'impression que ça viendrais plus de là.

Quant au B-mercapto, bien que couramment utilisé, c'est un mauvais réducteur, il en faut beaucoup. Si tu as un doute la dessus utilise plustôt le DTT qui est bien meilleur réducteur (et moins toxique).

byebye
chtefi

[invitefe7ff779]

Je viens de penser a autre chose. Quand tu fais le tampon de migration. Est ce que tu vérifies sont pH? Normalement avec la recette il doit être au bon pH sans que tu ai à l'ajuster, sinon il y a un problème. Mais si tu l'ajustes quand même alors fait le avec du tris concentré (Tris-Hcl ou Tris-Base selon le cas) c'est mieux que de le faire avec du Hcl....

chtefi