Recepteur à l'insuline en SDS PAGE

[inviteb9d21287]

Salut,
On a vu en cours que les recepteurs à l'insuline comportaients deux sous unité alpha et beta. J'aimerai savoir combien il ya de bandes en analyse par SDS-PAGE?
Merci
-----

[invitead282ff2]

Salut,


J'aurais tendance a dire deux, si elles sont de poids moléculaire différente.

[invitea0443c8c]

Salut!
En fait le récepteur à l'insuline est un hétérotétramère alpha2/bêta2 ou 2 fois un hétérodimère alpha/bêta si tu préfères (c'est la seule exception parmi les récepteurs tyrosine kinase qui présente 2 passages transmembranaires).
Effectivement on pourrait penser obtenir 2 bandes (une pour alpha et une pour bêta) mais je ne suis pas de votre avis....... ! En fait les sous unités sont reliées par des ponts dissulfures or le SDS ne clive pas les ponts dissulfures donc j'aurai tendance à dire que l'on obtient qu'une seule bande.
Pour obtenir les 2 sous unités il faudrait d'abord dénaturer au beta mercaptoéthanol (qui coupe les ponts dissulfures)!
C'est assez subtil .....

A+
Vinc

[inviteb9d21287]

Salut,
Je me suis peut être trompé en prenant mon cours mais j'ai mis que une des étapes du SDS PAGE, était la réduction des ponts S-S par du mercapto ethanol. Ou alors la technique du SDS c'est juste de faire migrer les protéines selon leurs poids moléculaire?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitea0443c8c]

Salut!
Bon en fait le SDS c'est un détergent anionique fort qui va dénaturer tes protéines et les charger négativement (ce qui explique pourquoi elles migrent toutes dans le même sens ) mais le SDS ne clive pas les ponts dissulfures!!! A l'inverse, le bêta mercaptoéthanol clive les ponts dissulfures c'est pour ça que lors d'une dénaturation en général on balance du SDS, du bêta mercapto et on chauffe à 100°C pendant quelques minutes.....
Un SDS PAGE c'est une électophorèse sur gel dans un tampon SDS dénaturant. Mais en fait j'ai été un peu trop pointilleux dans ma première réponse parce qu'on met de toute façon des thiols (=bêta mercapto) dans le tampon avec le SDS... Donc disons que si on te pose la question dans un examen, précise bien que le tampon de l'electrophorèse SDS PAGE contient de quoi rompre les ponts dissulfures (car ce n'est pas précisé explicitement dans le nom de cette électrophorèse)

A+
Vinc

[invitead282ff2]

Salut,

Je crois que le SDS permet d'"aligner" les protéines car ses charges anioniques fixant chaque acide aminé des protéines se répulsentles unes les autres, forcant les protéines à adopter la seule "structure" stable.
Par exemple:

(-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
K-- L--A--D-- R--V--V--G--C---M--L--A--D--R--S--
(-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

Ou chaque (-) représente une molécule anionique de SDS avec le code lettre pour chaque acide aminé (pris au hasard).

Voila comment, si mes souvenirs sont exact, l'électrophorèse avec SDS permet de faire migrer chaque protéine en fonction de son poids moléculaire...car celui ci est fonction de la taille du "baton" que forme la protéine en présence de SDS,et donc du rayon de stocke auquel celà correspond (*gros doute!?*)

Y'a que les résidus Proline qui faussent un peu le résultat en coudant légèrement l'édifice me semble t il.

Bref, sa permet de pas avoir a tenir compte de la forme de la protéine dans sa migration.

Morphine

[invitea0443c8c]

Oui c'est ce qu'on a déjà dit plus haut Le SDS charge toutes les prot négativement et les dénature!

A+
Vinc

[invitead282ff2]

Salut,

J'essayais juste d'expliquer pourquoi avec le SDS on avait une migration en fonction du poids moléculaire.
Ce ne serait pas le cas en absence de SDS ou avec une simple dénaturation.

Dénaturer la protéine ne doit pas suffir en soit à obtenir une migration fonction du PM.

Enfin je crois...

[invitea0443c8c]

Et bien oui tu crois bien mais c'est ce qu'on a dit au départ : le SDS charge négativement toutes les protéines. En fait, toutes les protéines vont avoir le même rapport charge/masse donc ce n'est pas ça qui va discriminer les différente protéines! C'est le gel qui va séparer les protéines selon la taille des mailles que l'on utilise (pourcentage en polyacrilamide). Pour les protéines, on utilise le polyacrilamide car les "mailles" sont plus petites donc c'est parfait pour séparer les petites molécules comme les protéines, mais pour les ADN/ARN, on utilise l'agarose qui permet de faire migrer des molécules nettement plus encombrantes que les protéines....

A+
Vinc

[invitec9f0f895]

Une petite precision,

Ce n'est pas le tampon de migration qui contient du beta-mercapto, c'est le tempon dans lequel est repris les protéines laemli. Cette etape, denature totalement la proteine (pont S-S compris). Ensuite la presence de SDS permet de faire migrer les protéine uniquement en fonction de leur poid moleculaire apparent.

Yoyo

[invitead282ff2]

Pour répondre a Vinc:

C'est bien pour ca que j'ai évoqué le rayon de Stocke.
Il me semble, mais mes souvenirs sont lointains (j'ai arrété mon master de biochimie il y a deux ans....) que toute protéine ayant chaque acide aminé coincé entre deux molécules de SDS adoptait tous une forme grossièrement en forme de baton.

Chaque baton est donc assimilable à une même protéine de forme sphérique "parfaite" de rayon théorique, dit rayon de Stocke. (pas sur de l''orthographe...).

Et donc, selon la distance de migration pour un type de gel donné sera associé à un rayon de Stock théorique....proportionnel à la taille de la protéine complexée par les molécules de SDS, et donc, proportionnel au poids moléculaire.


Bon, je ne suis peut être pas très clair.
Je vais peut être allé faire un tour sur mes anciens cours, la réponse doit s'y trouver, ou je confond peut être deux choses qui n'ont rien a voir.

Merci pour toute explciation,
Morphine

[inviteb9d21287]

Merci pour vos réponse . Bon alors en fait, comme je suis en première année de médecine, je ne fais pas de tp donc je ne fais que du théorique !
En quoi consiste un tempon? Et j'ai mis dans mon cours que on appliquait un champs électrique à la matrice interte mais est-ce que le champs électrique est maintenu lorsque l'on met les protéine dans la matrice?

[invitea0443c8c]

Une petite precision,
Ce n'est pas le tampon de migration qui contient du beta-mercapto, c'est le tempon dans lequel est repris les protéines laemli. Cette etape, denature totalement la proteine (pont S-S compris).

Oui méa culpa!! Je sais pas pourquoi j'ai dit ça surtout que j'ai bien dit ensuite de préciser que l'on rajoute du bêta mercapto au protocolle car ce n'est pas comprit dans le SDS PAGE !
Merci d'avoir précisé

Vinc

[invite2a651650]

juste pour être pointilleux, c'est Laemmli (2 M et un L majuscule).
sinon, le monsieur qui s'est échiné à créer la technique d'électrophorèse va se retourner dans sa tombe.

et pour info, si je me trompe pas:

Laemmli UK
Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.
Nature. 1970 Aug 15;227(5259):680-5.

son papier montrant la technique.