Tag His en N Ter???

[invitef44c5647]

Bonjour,

Je fais actuellement des constructions pour la production de protéines taguées 6XHis.
J'utilisais jusque là le vecteur pET-21a et me suis rendue compte que le tag se trouvait en C ter. Malheureusement, la structure 3D de ma protéine fait qu'il se retrouve ensuite à l'intérieur et n'est donc pas accessible pour la purification sur colonne de nickel.
Je voudrais savoir s'il existe un moyen, à partir de ce même plasmide, d'obtenir un tag His en N Ter. Je ne pense pas car il fait de telle sorte que le tag se trouve après le polylinker.
Existe-t-il des plasmides permettant d'avoir une protéine taguée en N-Ter. Sachant que j'utilise l'IPTG pour exprimer et produire ma protéine dans des bactéries E.Coli. J'ai donc besoin d'un opéron lactose (lac).

Merci d'avance.
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[piwi]

Au pire tu mets toi même ton tag en Nter et tu termines ton insert par un STOP. Comme ça t'es tranquille ^_^

[invite17a570c1]

Au pire tu mets toi même ton tag en Nter et tu termines ton insert par un STOP. Comme ça t'es tranquille ^_^

+1
Ca marche très bien, j'ai déjà utilisé avec des pET-24 et pET-28.

[Zellus]

Salut,

Existe-t-il des plasmides permettant d'avoir une protéine taguée en N-Ter. Sachant que j'utilise l'IPTG pour exprimer et produire ma protéine dans des bactéries E.Coli. J'ai donc besoin d'un opéron lactose (lac).

Je connais deux plasmides qui peuvent t'intéresser : le pETM-11 de l'EMBL que tu trouveras sur cette page et le pET-15b de Novagen que tu trouveras sur ici. Il y a plein d'autres plasmides sur ces deux pages donc je pense que tu devrais trouver ton bonheur.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitef44c5647]

Envoyé par piwi
Au pire tu mets toi même ton tag en Nter et tu termines ton insert par un STOP. Comme ça t'es tranquille ^_^

Tu veux dire que lors de la PCR au cours de laquelle j'introduis mes sites de restriction spécifiques, je "design" les amorces de telle sorte qu'elle contienne à la fois le tag his et le site de restriction d'un côté et de l'autre le site de restriction suivi du codon stop?
L'amorce avec le tag his et le site de restriction ne sera-t-elle pas trop grande?

Merci beaucoup. Je vais reflechir à vos propositions.

[piwi]

C'est exactement cela. Il faut juste bien faire attention à la phase.
Sinon, l'amorce ne sera pas trop grande tu peux y aller sans crainte.

Cordialement,
piwi

[invitef44c5647]

Jusqu'à combien de bases puis-je aller?
N'y aura-t-il pas un problème si mes deux amorces sont de taille différente?!
Il faudrait donc que je fasse une amorce avec codon stop qui "empiète" plus sur la séquence de mon insert.. Non?
Merci beaucoup!!

[gorben]

Salut,

Tu peux synthetiser des amorces jusqu'a 100 pb. Au dela de 60/70 pb par contre, il faut demander une purif PAGE pour etre sur que tu ais tes amorces de la taille voulue.

A+