Problème de transformation

[invite6674eac4]

voila apres ligation de mon insert:

buffer10X 2µl
vecteur: 1µl
insert:1µl
ligase T4 (roche):1µl
overnight 4°

je transforme
sous c condition

cellule d'E.Coli (+CaCl2) à -80° decongeler dans la glace (45MIN)
j'ajoute mon plamide (10µl 1ng)
jattend 30min dans la glace
90s a 42°
30min dans la glace
et une heure dans avec le milieu de culture

j'obtien en deux jour a température ambiante de très petite colonie transparente et j'ai remis une nuit à 37°

et ca ne pousse pas

je vous sollice donc car je ne comprend pas à je ne pense pas que ce sois des contaminant ( milieu slectif a la kana)

merci
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[invite772cf17c]

déjà, des colonies transparentes... ca ne doit pas être du E. coli, en effet !

pour ton protocole de ligation, tu as un buffer 10x, mais au final il n'est dilué que 5 fois ! est-ce que tu es bien sûr d'avoir mis les volumes que tu nous indiques ? est-ce que tu as complété avec de l'eau ?

Moi perso, j'ai jamais ligué à 4° overnight, je le fais plutôt à 37° (plus ou moins, selon l'enzyme), mais ca dépend du protocole fourni par roche.

Tu as fait une vérif de concentration (spectro UV) après ligation ? et une vérif de ligation en faisant migrer ton produit de ligation sur agarose ? on peut peut-etre envisager (selon ce la précision que tu désires) une PCR sur produit de ligation avec des amoces de ton gène d'intérêt ou du gène kan^R.

Enfin, quel est le volume de culture dans lequel tu as fait pousser tes bactéries après la transformation ? est-ce qu'il y avait déjà de la kanamycine dedans ? et quel volume as-tu utilisé pour étaler sur ta boite ?

Pour savoir ce que c'est qui pousse... des colonies transparentes, aucune idée ! mais ca peut être des contaminant ! certaines bactéries peuvent développer rapidement une résistance à la kanamycine, surtout dans un labo ou cet antibio est utilisé couramment. D'où l'intéret de toujours vérifier que les colonies que tu isoles sont résistantes en raison de la présence du plasmide, et non d'une mutation spontanée. Ceci dit, si tes bactéries 'transparentes' ne poussent pas quand tu les repiques, ca veut dire que c'est des faux positifs.

bon courage !

Josquin

[invite6674eac4]

merci de pour t suggestion

pour la ligation ya je pense qui il a un pb a la base mon enzyme et mon buffer ne vienne pas de lameme boite donc faut que je check ca

en suite pour la transfo i let possible que toute mes cellule soit morte pendant le choc thermique en effet peu etre devrai je attendre 45s au lieu de 90s

je depose 100ml de transformation sur ma boite contenan la kana dans le gel

Je n'est pas repique mes colonie je l'avaus laisse le week end a t° ambiente (20°) il y avait donc c petite colonie hier puis j'ai mi la boite à 37° me disant que ca aller pousser plus vite et ba non ca na pas bouge alor meme si ce son des contaminant il aurai du pousser eu aussi

ma manip etai sou hote avec bec electrique alors niveau stéril ca devrai aller

javou je bloque car javai ce qui faut sur mon gel de control apres ligation

[invite772cf17c]

pour la ligation ya je pense qui il a un pb a la base mon enzyme et mon buffer ne vienne pas de lameme boite donc faut que je check ca

javou je bloque car javai ce qui faut sur mon gel de control apres ligation

ouais, ca peut etre utile. Regarde surtout la composition du buffer à utiliser. même si ca n'est pas la même marque, ca devrait marcher quand même. Mais a priori, ta ligation a marché, donc ca sert pas à grand chose de t'embêter avec le buffer.

en suite pour la transfo i let possible que toute mes cellule soit morte pendant le choc thermique en effet peu etre devrai je attendre 45s au lieu de 90s

Je ne pense franchement pas que ca ait la moindre influence. le choc thermique est important ! si tu diminues la vitesse, tes bactéries n'auront même pas le temps d'être transformées !! et 42°C, pour E. coli, ca n'est pas optimal, mais c'est pas non plus comme si tu les laissais une heure à 60°C, ca ne va certainement pas les tuer !

je depose 100ml de transformation sur ma boite contenan la kana dans le gel

ok... tu es sûr que c'est pas plutôt 100µL ??

Je n'est pas repique mes colonie je l'avaus laisse le week end a t° ambiente (20°) il y avait donc c petite colonie hier puis j'ai mi la boite à 37° me disant que ca aller pousser plus vite et ba non ca na pas bouge alor meme si ce son des contaminant il aurai du pousser eu aussi

ok, on est d'accord. de facon générale, il vaut mieux toujours faire les cultures d'E. coli à 37°C, sinon ca pousse quand même pas très bien. d'ailleurs, après transfo, tu as fait pousser tes bactéries 1h (ca me parrait très peu, mais bon...) A quelle température ?

ma manip etai sou hote avec bec electrique alors niveau stéril ca devrai aller

je sais pas ce qu'est un bec électrique ! wow, ben t'as pas peur de contaminer tes hotes !

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