Bonjour,
Nous avons un problème lors de nos extractions d'ARN totaux.
Le ratio 260/230 est mauvais !!
Il s'agit d'extraction d'ARN totaux sur culture primaire de macrophages alvéolaires de rat.
Les cellules sont disposées en plaque 6 puits (10 millions de cellules par puit) et exposées à un toxique.
Nous avons testé l'extraction au trizol et le kit QIAGEN RNeasy plus Mini ...
Je sollicite votre aide et conseils ...
Merci beaucoup.
Bonjour,Envoyé par Soso23
- Quid du ratio 260/280 ?
- L'absorbance à 230nm est lié à la présence de cycles aromatiques, tels que de certaines acides aminés ou le trizol. Il est possible qu'il vous reste du Trizol
Avez-vous essayé quand même de faire vos manips avec vos ARN ? Je ne mesure jamais ce ratio et j'arrive cependant à avoir de très beaux résultats avec mes ARN (bactériens certes)
les ratio 260/280 sont corrects (en moyenne autour de 2) mais les quantités extraites ne sont pas super (surtout sur colonne)
c'est un travail en collab, et ce n'est pas nous qui faisont les q-PCR.
pour les extractions trizol, c'est certainement ça la cause de la conta, mais pour les extractions colonnes je ne comprends pas ...
De plus, nous utilisons le Nanodrop8000 pour les dosages, appareil très sensible, pas le droit à l'erreur !
Avez vous un protocole d'extraction au trizol que vous avez testé et qui donne de bons résultats ?
Merci beaucoup.
Bonjour,
qu'entendez-vous par "quantités pas super"? Quelles sont les ordres de grandeur des concentrations?
Pour avoir utilisé le kit Qiagen et le nanodrop, je peux seulement vous dire qu'à chaque que j'avais une concentration faible et un mauvais ratio 260/230, c'est que mon ARN était dégradé. Il est effectivement très rare d'avoir une contamination à 230 nm avec les kits qui sont plutôt bien mis au point.
Avez-vous un moyen de vérifier la qualité de vos ARNs (bioanalyseur...)? Est-ce que la courbe d'absorption du NanoDrop est bonne?
Cordialement
Non, nous n'avons de bioanalyseur.
La courbe d'absorption ne révèle pas de pic à 230, mais celui à 260 est très faible.
Les quantités obtenues après passage sur colonne sont de l'ordre de 10 ng/µl ... beaucoup trop faible à mon sens.
Au trizol, les quantités extraites étaient plus importantes, mais cette fois, on avait clairement un pic à 230 nm ...
... merci ...
Et tu peux pas faire migrer 500µg sur gel? tu verras déjà si ils sont beaux?!
Bien sure si t'en a pas beaucoup.... que ça t'es précieux...
une petite remarque concernant le ratio; il est très important de le calculer pour connaitre le degré de pureté de votre ARN. c'est une sorte de témoin pour votre manipulation.
