Méthode Cre-Lox : application ?

[invite4f80dcbf]

Bonjour,

J'aurais une question par rapport à la méthode Cre-Lox tout en ignorant si son utilisation est courante.

Nous souhaitons "floxer" un gène, on doit donc l'encadrer par deux séquences "Lox". Comment s'y prend-on, expérimentalement, pour précisément encadrer une séquence génique particulière ?

On nous a expliqué à quel point les recombinaisons "au hasard" étaient prédominantes. Hors rien ne nous a été dit sur la difficulté éventuelle à "floxer" très précisément une séquence donnée (pour, ensuite, s'amuser comme on l'entend avec la séquence en question, grâce à la recombinase Cre).

Je vous remercie
-----

[invite71f23525]

On insère les sites LoxP de part et d'autre du gène d'intérêt par recombinaison homologue. C'est à dire qu'on prend la séquence des parties flanquants le gène, pour chacune d'elles, on y ajoute le site LoxP. Chaque séquence modifiée (une par partie flanquante) est intégrée dans un vecteur (plasmide ou virus). Les cellules sont transfectées (plasmide) ou transduites (virus). Une fois l'ADN exogène dans le noyau, les parties homologues vont s'intégrer au niveau d'un des deux brins d'ADN du gène d'intérêt par recombinaison homologue (voir les protéines BRCA2, Rad50, Rad51 pour la compréhension de ce processus chez l'Eucaryote supérieur) car elle correspondent précisément aux séquences des parties flanquantes.

La procédure classique consiste à intégrer un site, cribler, puis sur les clones possédant un site Lox, réaliser la deuxième recombinaison avec le deuxième site Lox, cribler et sélectionner le (s) clone (s) qui possèdent les deux sites LoxP. Un séquençage permet de s'assurer de la position des sites, et on peut (doit) faire une PCR avec des amorces spécifiques des deux parties intégrées pour s'assurer qu'on n'a pas d'intégration de sites LoxP ailleurs dans le génome. Petite parenthèse à ce sujet, dans les séquences flanquantes modifiées qui vont s'intégrer à la région voulue, on ajoute assez loin des régions homologues le gène de la thymidine kinase. Sa présence dans les clones indique une intégration non spécifique.

Greg

[piwi]

Je pense que la mutagénèse conditionnelle dirigée ne s'improvise pas vraiment. Ce ne sera pas ici que l'on pourra vous donner une aide complète pour obtenir vos mutants. Une bonne option serait d'acheter un textbook. Ce n'est peut être pas donné donné mais vous en aurez vraiment besoin.

Cordialement,
piwi