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Adénovirus et cre-lox



  1. #1
    chanelle

    Adénovirus et cre-lox


    ------

    Bonjour, je suis étudiante au Ph.D. et j'aimerais savoir si quelqu'un d'entre vous peut m'expliquer comment un fabrique des adénovirus recombinant à l'aide d'un système cre-lox?
    merci!
    Chanelle

    -----

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  3. #2
    Elendilmir

    Re : Adénovirus et cre-lox

    Ca je peux faire, c'est mon métier ^^

    Alors dessin fait à partir de mon pauvre clavier :

    ITR_Y---------loxP-??-loxP--------ITR

    Y etant Psy, la séquence d'encapsidation de l'ADN adénoviral, et --- l'ADN viral

    Avec ce système tu peux créer des délétions, inversions ou insertions de fragment d'ADN.

    La recombinase Cre (spécifique de la séquence de loxP) va couper loxP et va coller les fragments.

    Si tu as :

    =loxP=>......=loxP=> tu auras une délétion

    =loxP=>......<=loxP= tu auras une inversion

    =loxP=> et un autre fragment d'ADN à insérer où tu as les moitiés de loxP flanquantes, tu peux avoir uue insertion...

    Un exemple pratique d'utilisation du système cre-lox est la fabrication de vecteurs haute capacité avec des vecteurs dit Helpers, dans des cellules exprimants Cre pour éviter d'encapsider l'ADN du virus Helper (je peux expliquer de manière plus approfondie).

    Il existe un autre système que celui-ci, le système de recombinaison RedEt, si ça te tente, je peux aussi l'expliquer, ou donner des ref
    Qui s'assied au fond d'un puits pour contempler le ciel le trouvera petit.

  4. #3
    chanelle

    Re : Adénovirus et cre-lox

    Ok, j'suis pas experte en la matière et je suis poche en bio mol mais j'essaie de te dire si j'ai compris. Moi j'ai besoin de créer un adénovirus avec un gêne inséré dedans (exMEF2DS444A), je prends donc une vecteur (adénovirus?)contenant un

    ITR_Y---------loxP>-??-ITR ???

    et je combine avec avec le gêne à insérer dans un vecteur contenant aussi

    ITR------loxP--gene a insérer----lox P---ITR ????

    ( je ne comprends pas les moitiés de lox p?)
    la recombinase va couper les cre et insérer le gêne dans le vecteur?

    Merci de ton aide très précieuse!! Et pardonne mon ignorance dans ce domaine!!

    Chanelle

  5. #4
    Elendilmir

    Re : Adénovirus et cre-lox

    Là, j'ai pas le temps de te faire une jolie réponse, mais je vais y revenir un peu plus tard...
    Es tu sure de vouloir faire ca par CreLox?

    Parce que rien que les fragments flanqués, ca peut etre long préparer...

    Tu as un kit de recombinaison dans ton labo?
    C'est la première manip que tu vas faire avec de l'ADN d'adeno?

    Ps: pardon pour les accents manquants
    Qui s'assied au fond d'un puits pour contempler le ciel le trouvera petit.

  6. #5
    Elendilmir

    Re : Adénovirus et cre-lox

    Alors pour insérer qqch (je vais faire autrement pour les demi sites, ce sera plus simple ^^ ) dans un fragment d'ADN par recombinaison Cre-Lox:

    Tu as ta cible :

    -----------------==loxP==>------------------

    et ce que tu veux insérer :

    -----------------==loxP==>---gène à insérer------
    circulaire et contenant ton gène reporter, ou ta mutation,ou le gène que tu veux véhiculer...
    (je sais pas faire de cercle sans insérer une image, mais tu dois pouvoir voir ce que je veux dire)

    Qd tu mets Cre dans le système (in vitro ou in vivo), il se passe une coupure au milieu du site loxP de chaque ADN, et les deux sont collés:

    -----------------====>--- gène inséré ---== ==>------------------


    Pb n°1 : soit ton ADN ciruclaire contient des portions d'ADN bactérien dont il faut se débarasser, soit il faut faire des minicercles plasmidiens (minicircles en anglais je crois, je sais pas l'exacte traduction en francais).

    Pb n°2 : la proba de recombinaison, qui est assez faible, il existe des mutants Cre qui permettent une meilleure efficacité

    Pb n°3 : l'adéno aime pas avoir des seq loxP dans son génome, donc à moins de trouver un truc pour s'en débarasser, je déconseille d'utiliser ce système (adéno parlant)

    Voilà ^^
    Qui s'assied au fond d'un puits pour contempler le ciel le trouvera petit.

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    chanelle

    Re : Adénovirus et cre-lox

    Merci b eaucoup Elendilmir"! maintenant j'ai compris....j'suis pas vite vite excuse moi mais ce n'est vraiment pas mon domaine! En fait je ne veux pas faire ca je veux juste comprendre parce que c'est quelque chose que je dois expliquer pendant mon examen doctoral et je n'arrivais pas a bien comprendre. Encore une fois merci!
    @+

    Autre petite question, le transport rétrograde des adénovirus tu connais? Je suppose que cela dois s'expliquer par le fait qu'il y a un récepteur particulier pour une protéine de l'enveloppe du virus?

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  10. #7
    Elendilmir

    Re : Adénovirus et cre-lox

    Par transport rétrograde, tu entends transport vers le noyau?

    Si oui, alors (j'étale ma science si tu permets et je repars du début) l'adéno se lie aux cellules via les héparanes sulfates (hépatocytes par exemple) et aux récépteurs CAR et intégrines (alpha v béta 3/béta 5) via la protéine Fiber et Penton Base respectivement (proteine des spicules et de leur base).

    Ensuite il y a endocytose qui commence et la protéine Fiber est "coupée" du virus. Le virus sans spicules entre donc dans les endosomes.
    S'il reste là, il est foutu...

    Le pH diminuant, la caspide se démantèle doucement, par paquet, pas vraiment en finesse. Penton Base, puis découpement de la capside laissant apparaitre la proteine intracapsidique pVI qui va "aider" la coquille restante à rentrer dans le cytoplasme.

    Là, l'adéno se lie aux microtubules via la dynéine (cf inner life of the cell ) et va s'apponter au noyau au niveau des proteines Nup214/Can.

    Puis, ce qu'il reste de caspide, surtout faite d'hexon, de pVII, sans doute de pIX et d'ADN, va entrer en "communication" avec le noyau qui va via les importines Béta et 7 et l'histone H1 faire rentrer l'ADN viral qui est toujours attaché à la protéine Hexon...

    Et tout ce petit monde va prendre possession de la machinerie cellulaire et on connait la suite ^^

    Il y a un papier d'Urs Greber sur le sujet si tu veux encore plus de détail
    Dernière modification par Elendilmir ; 30/11/2006 à 15h09.
    Qui s'assied au fond d'un puits pour contempler le ciel le trouvera petit.

  11. #8
    Elendilmir

    Re : Adénovirus et cre-lox

    Pour en revenir sur le système de recombinaison Cre lox, pour ta présentation, tu peux parler des problèmes qui peuvent être rencontrés, et dire qu'il y a d'autres systèmes de recombinaison peut etre théoriquement plus compliqués mais plus simples à mettre en oeuvre et tout aussi spécifiques

    (je parle du système de recombinaison dérivé du phage lamba je crois, RedEt. On prend 50pb flanquantes de chaque coté de l'emplacement qu'on cible et on fait deux oligos longs contenant chacun une région flanquante et une partie du gène à insérer, selon l'orientation, on fait une PCR avec sur le gène à insérer,puis recombinaison dans E coli. Il y a un système de sélection de clones modifiés post recombinaison, et c'est tout bon normalement, il y a des publis dessus, je peux donner les ref, si besoin)
    Qui s'assied au fond d'un puits pour contempler le ciel le trouvera petit.

  12. #9
    chanelle

    Re : Adénovirus et cre-lox

    Cool, merci beaucoup! Tu es très gentil(le)?! j'apprécie beaucoup et ca m'aide vraiment! Je vais penser a toi durant mon examen!
    Je suis du QUébec alors si jamais vous passez dans le coin!!!
    A+

  13. #10
    Elendilmir

    Re : Adénovirus et cre-lox

    Gentille (El, c'est féminin hihi)

    Bon courage et dis nous comment ça s'est passé.
    Qui s'assied au fond d'un puits pour contempler le ciel le trouvera petit.

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