Dosage des protéines totales méthode de Bradford.

[invite15518c50]

Bonjour, je veux faire le dosage des protéines totales par la méthode de Bradford.
Le protocole me dit ceci :
Nous avons réalisé avec le sérum d’albumine bovine SBA comme protéine standard, une courbe étalon à six points de concentrations croissantes ( 0 ; 0,25 ; 0,5 ; 1 ; 1,4 ; 2 mg SBA/ml).
Nous avons suivi les étapes ci-dessous, pour le dosage des concentrations
en protéines au niveau des échantillons des différents organes ciblés :
• 0,1 ml de chacun de nos échantillons et les solutions filles de BSA sont
mélangés à 3ml de réactif de Bradford pour un volume final de 3,1 ml.
• Après une incubation de 5 à 45 minutes, ce mélange est transféré dans des
cuves à spectrophotomètre.

Pour quoi on prend 0,1 ml de SBA et on le mélange au 0,1ml de l’échantillon puis on ajoute le colorant ?
On veut mesurer les protéines dans l’échantillon, et on ajoute le colorant puis c’est tout. Pour quoi ce SBA ?
Et pour quoi on fait cette courbe ?
A me sens il est suffisant : qu’on mélange x ml de l’échantillon et x ml du colorant, ils se lient, on regle le sepectro à 995 nm, le melage absorbe le rayon monocromatique. Et si le spectro afiche par exemple A=0,412 ça corespend à 20 micrograme.
Si ça ne marche pas comme ça comment ça marche alors ?
Merci beaucoup
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[invitee6ff9322]

ta gamme étalon va te permettre justement de paramatrer ton spectro
Il y a deux méthodes
Tu lit l'absorbance de ta gamme étalon et trace ta courbe tu auras un courbe de l'absorbance en fonction de la quantité de protéine présente dans tes tubes.
La seconde façon c'est le spectro qui le fait il garde en mémoire la courbe quand tu teste tes tubes pour la gamme étalon.

Par contre tu as raison sur le fait qu'il faut ajouté suelement le colorant de bradford à ta solution dans laquelle est présente la protéine. (pas d'ajout de BSA)

Dans les deux cas quand tu testeras ton tube contenant ta protéine et le colorant, tu va obtenir une DO que tu repporte sur le graphe que tu a tracer manuellement ou c'est le spectro qui le fait automatiquement.

j'espere avoir été clair

[invite96114527]

Bonjour

j'ai une question à vous poser, lors de la préparation de la gamme étalon SBA est ce qu'on utilise pour la dilution l'eau distillée ou le tampon avec lequel on a fait l'extraction des protéines?

merci d'avance

[Flyingbike]

idéalement il faut utiliser le même tampon, en effet, puisque certains composés de certains tampons ont une absorbance propre. Après, ça dépend des conditions de mesure, par exemple moi qui mets 1 µL d'échantillon dans 1mL de réactif, je ne me pose pas la question.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite96114527]

Bonjour

je ne parle pas d'ici de la dilution de l'échantillon,mais je parle de la dissolution de SBA;Est-elle dans de l'eau distillée ou dans le tampon d'extraction?
j'ai d’autres questions:
lorsque vous ajoutez un volume x de l’échantillon à un volume x de réactif de bradford, le mélange est agité à vortex ou à main?
et combien de temps nécessaire pour l'incubation (à l'obscurité ou non)?
on utilise pour la lecture du DO des cuves en quartz ou en plastique?


merci d'avance

[berzelius]

bonjour,

je ne parle pas d'ici de la dilution de l'échantillon,mais je parle de la dissolution de SBA;Est-elle dans de l'eau distillée ou dans le tampon d'extraction?

Personellement, je le fait dans le tampon d´extraction, pour être sur que l´influence du tampon soit reduite au maximum.

lorsque vous ajoutez un volume x de l’échantillon à un volume x de réactif de bradford, le mélange est agité à vortex ou à main

A mon avis, peu importe, si c´est en tube, cela revient au même, par contre pour une microplaque, je melange a la pipette, puis je met a agiter sur un agitateur, pour homogeneiser et pour retirer toute possible bulle.

et combien de temps nécessaire pour l'incubation (à l'obscurité ou non)

Mon protocole indique 15 min a l´obscurité a RT... je n´utilise que celui là, je ne sais pas plus.

on utilise pour la lecture du DO des cuves en quartz ou en plastique

euuh bonne question, par habitude je prends des microplaques utilisables pour les UV, en plastique spécial donc, mais je n´ai que cela a disposition, je cede la place à ceux qui savent...

a bientot,

[Flyingbike]

pour les cuves peu importe, en PS, en PMMA, en PC, ça passe à la longueur d'onde de lecture.

[invite96114527]

Merci beaucoup pour l'explication