Méthode de Bradford

[invite477a22ba]

Bonjour

Le réactif de bradford se lie aux chaines latérales des acides aminés basiques (arg, lys...). Ceci entraine un déplacement de son absorbance de 465nm à 595nm. Cela permet de doser par spectrophotométrie des protéines.

Quel est l'intérêt d'effectuer un tel dosage alors que pour doser des protéines il suffit de le faire a 280nm grâce à l'absorbance des aa aromatiques. Cela me parait plus simple mais j imagine que si on prend la peine d'utiliser bradford c est qu il propose certains avantages...?

merci
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[invitea0443c8c]

Bonjour!
Je n'ai pas de réponse précise mais je suppose qu'il a une relation avec l'abondance relative des différents acides aminés importants pour l'un ou l'autre type de dosage.

V.

[invite477a22ba]

Merci pour la réponse.

ça serait donc peut être une question "d'amplification de l'absorbance" histoire de pouvoir détecter des quantités plus faible ?

[invite17a570c1]

Salut,

Si j'ai une protéine qui n'a pas ou très peu d'aa aromatiques, j'en fait quoi avec 280 nm? Pas grand-chose. Surtout que c'est le tryptophane qui absorbe essentiellement à cette longuer d'onde, la phénylalanine et la cystéine le font faiblement. La sensibilité n'est pas terrible non plus (si je me souviens bien, c'est de l'ordre du 50-100µg). Mais le problème majeur est dans les acides nucléiques : ils absorbent très fortement à 254 nm, donc un simple contaminant de ta protéine et tout est faussé... Il te faut donc un protéine pure, toute seule (parce que le mélange et l'absorbance à 280nm, ce n'est pas le top...), en quantité assez importante.

En ce qui concerne le Bradford, le bleu de Coomassie est très sensible, il ne complexe pas seulement avec les chaînes latérales de la Lys et Arg, mais aussi avec l'Histidine. Et il te permet de détecter des quantités entre 5 et 10 µg , ce qui est déjà mieux. Et en plus le bleu de Coomassie ne craint pas les interférants, il détecte les 3 acides aminés, point.

Cordialement,

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite477a22ba]

ok merci bien

[invite802886a4]

bonsoir,
de mon coté je rencontre des difficultés pour tracer la droite,je sais que ça sera la DO en fonction de la concentration de BSA.mais le problème c'est qu'on a utilisé 5 tubes dont un est le blanc plsu deux autres de 1/10 et 1/100 de serum dilué (notre échantillon à doser est l'immun serum),dans ce cas la comment je tracerai ma droite?est-ce qu'elle passera par le zero ou non?et comment interpréter mes résultats?

[invite802886a4]

oups désolé!!!!!!! j'espere vraiment avoir une réponse et je vous remerci d'avance.byye

[inviteb6144ea4]

Bonjour,

et bien c'est simple. Normalement tu dois connaitre la concentration de tes 5 tubes qui contiennent de la BSA (concentration différente à chaque fois, qui double par exemple). A partir de là, tu as du les doser et tu connais donc maintenant leur DO.
Tu n'as plus qu'à tracer tes cinq points dans le graphe qui représente la DO en fonction de la concentration et tracer la droite. Je dis bien: droite. Ne relie pas les points entre eux mais fais une régression linéaire (une droite "moyenne" si tu préfères)
Ensuite tu reportes sur la courbe la DO que tu as obtenu pour tes deux échantillons (1/10eme et 1/100eme) et tu n'as plus qu'à lire la concentration de tes échantillons (en n'oubliant pas de rétablir le facteur de dilution). Pour être plus précis tu peux également calculer la concentration à partir de l'équation de la droite. A toi de voir.

Cordialement

[invite802886a4]

merci beaucoup,je vous avoue que vous m'avez eclaircis tous le probleme et que ça m'a beaucoup aidé à résoudre mon travail.merci encore.agréable soirée.