Apres avoir lu les differents messages sur le sujet (souvent tres informatifs comme ceux d'Annaick) je continue tout de meme a me poser des questions au sujet de la qPCR.
J'ai l'impression que ces deux techniques (quantification absolue et relative) sont finalement plus complementaires qu'alternatives...ou alors c'est que je n'ai pas tout a fait compris.
Prenons un exemple, on a une condition standard et une condition a tester et on veut connaitre une eventuelle surexpression/sousexpression d'un gene dans la condition experimentale par rapport a la condition standard.
Pour moi je ne vois pas comment dans ces conditions on pourrait proceder sans introduire l'etude d'un gene dont l'expression ne varie pas que je nommerai gene controle.
Je ferais uns qPCR (en triplicats) qui me permettrait d'obtenir les valeurs de CT pour :
- le gene teste dans les conditions standards
- le gene controle dans les conditions standards
- le gene teste dans les conditions experimentales
- le gene controle dans les conditions experimentales
Grace a cela je pourrais calculer successivement le deltaCt (qui me permet une normalisation) puis le deltadeltaCt et connaitre ainsi le nombre de copies en plus ou en moins de mon gene teste dans les conditions experimentales par rapport aux conditions standard en calculant E a la puissance deltadeltaCt.
* Si je n'ai pas l'efficacite je considererais que E = 2 mais si cela ne me convient pas je pourrais faire des dilutions de RT du gene teste, passer ces dilutions en qPCR et a partir de la calculer l'efficacite (est-ce correct ?)
* Si je veux ramener cela non pas a un simple nombre de copies en plus ou en moins par rapport a la condition standard, je vais devoir faire des dilutions (de plasmide + gene teste ou d'ADN genomique ou autre...) afin de faire coincider les valeurs de Ct a une concentration etc...en tous les cas a une valeur absolu. (Est-ce toujours correct ?)
Si mon raisonnement est correct, on voit bien qu'on a d'abord utilise une technique relative pour evaluer une possible surexpression ou sous-expression qui a ete complete par un technique absolu pour obtenir un resultat plus satisfaisant. Ai-je oublie quelque chose ? Aurait-on pu proceder sans utiliser de gene controle ? Doit-on utiliser un autre gene en plus du gene teste et du gene controle ?
Merci par avance a ceux qui repondront a ce long, long sujet...
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Envoyé par piwi 