Problème d'amorces

[invited9333719]

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Bonjour,

Je suis en première année de Biologie à jussieu (Paris 6) et j'ai un souci concernant un exercice sur le séquençage:

Par PCR, nous voulons amplifier l'exon 3 d'un gène responsable d'une maladie génétique.

Voici la séquence :

5' - atattccttc ccagatggag ACTATGTGCC AACCTGGAAG GTGGCATTAA GCGCTTAAGC CAGCTGCCCA TGCCACTCGT AACCCGGTGG CCCATGACTC tgcactgagg tcatgctcag - 3'

Les séquences introniques sont en minuscules et les séquence de l'exon 3 (qu'on veut amplifier), en Majuscules.

La question est la suivante : Proposez les séquences (avec leur orientation) d'amorces de 20 nucléotides permettant d'amplifier l'exon 3.

Moi j'en ai trouvé une pour l'extrémité 3' du gène, mais pour le 5' j'ai du mal à placer l'amorce, car en plaçant l'amorce sur l'extremité 5', on aura une synthèse débutant au 3' de l'amorce , et donc vers la gauche (la séquence synthétisée se trouvera hors du gène), je ne sais pas si vous me comprenez.

Je vous remerci infiniment de m'éclairer car je suis perdu.

A bientôt
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[piwi]

5' - atattccttc ccagatggag ACTATGTGCC AACCTGGAAG GTGGCATTAA
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GCGCTTAAGC CAGCTGCCCA TGCCACTCGT AACCCGGTGG
-----------------------------------------<-----------
CCCATGACTC tgcactgagg tcatgctcag - 3'
-------------

J'ai un peu du mal à cerner où se trouve la difficulté. Bon en même temps je fais cela tous les jours. Qu'est ce qui vous pose problème?

Cordialement,
piwi

[invited9333719]

5' - atattccttc ccagatggag ACTATGTGCC AACCTGGAAG GTGGCATTAA
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GCGCTTAAGC CAGCTGCCCA TGCCACTCGT AACCCGGTGG
-----------------------------------------<-----------
CCCATGACTC tgcactgagg tcatgctcag - 3'
-------------

J'ai un peu du mal à cerner où se trouve la difficulté. Bon en même temps je fais cela tous les jours. Qu'est ce qui vous pose problème?

Cordialement,
piwi

On me demande de proposer des amorces qui permettent d'amplifier la séquence de l'éxon 3 (en Majuscule), les amoces (de 20 nucléotides) devront être posées sur les séquences introniques (en amont et en aval). Seulement, j'ai appri que l'ADN polymérase synthétise de l'ADN dans le sens 5'-->3', or si on pose l'amorce sur la partie de gauche, on aura par complémentarité,


3' - tataaggaag ggtctacctc - 5'
5' - atattccttc ccagatggag ACTATGTGCC AACCTGGAAG

GTGGCATTAA GCGCTTAAGC CAGCTGCCCA TGCCACTCGT

AACCCGGTGG CCCATGACTC tgcactgagg tcatgctcag - 3'

Le sens de synthèse est de 5' à 3' de l'amorce, soit une amplification d'une séquence à gauche (qu'on ne veut pas):

(sens)
<-----
3' - tataaggaag ggtctacctc - 5'
5' - atattccttc ccagatggag - 3'

Merci beaucoup.

Cordialement

[piwi]

Je ne comprends pas pourquoi vous tapez dans un intron si vous souhaitez amplifier un exon. Enfin passons.
Maintenant pensez bien que l'ADN est double brin.

5' - atattccttc ccagatggag ACTATGTGCC AACCTGGAAG - 3'

5' - atattccttc ccagatggag --->
3' - tataaggaag ggtctacctc TGATACACGG TTGGACCTTC - 5'



5' - CCCATGACTC tgcactgagg tcatgctcag - 3'
3' - ---------<---acgtgactcc agtacgagatc - 5'

3' - GGGTACTGAG acgtgactcc agtacgagatc - 5'

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[invited9333719]

Ah n'y avais-je pas penser!

Merci beaucoup Piwi, j'ai mieux compris. Il fallait se dire, au départ que c'était double brins. Ils auraient dû le préciser dans l'énoncé (ça m'aurait éviter de passer du temps sur l'éxo ) mais bon...

En tout cas merci pour ton aide.

Cordialement

[piwi]

En même temps on parle d'un gène. Vous connaissez beaucoup de gènes simples brins?

[invited9333719]

En terminal, je n'était pas excéllent en biologie, je débute ma premiere année, je n'ai pas encore les réflèxes nécessaires...alors j'ai d'abord penser que, comme on effectuait un PCR, les ADN sont forcément doubles brins. Je n'ai pas pensait au fait qu'on parlait de gène, et que l'ADN est donc double brin. Merci pour l'info

Cordialement

[helplachimie]

Je ne comprends pas pourquoi vous tapez dans un intron si vous souhaitez amplifier un exon. Enfin passons.
Maintenant pensez bien que l'ADN est double brin.

5' - atattccttc ccagatggag ACTATGTGCC AACCTGGAAG - 3'

5' - atattccttc ccagatggag --->
3' - tataaggaag ggtctacctc TGATACACGG TTGGACCTTC - 5'



5' - CCCATGACTC tgcactgagg tcatgctcag - 3'
3' - ---------<---acgtgactcc agtacgagatc - 5'

3' - GGGTACTGAG acgtgactcc agtacgagatc - 5'

Cordialement,
piwi

En fin de compte il me semble que c'est YAVNI88 qui avait raison pour amplifier l'exon par pcr il faut commander la séquence de l'amorce antisens de l'intron ,on lit la séquence de l'intron de 3' en 5' et on écrit le brin complémentaire