séquences d'un couple d'amorces pour pcr

[invitee2a6b456]

bonjour
je suis technicien biologiste, et j'ai un souci. En fait je me pose la question de savoir comment se prépare ou se fabrique un couple d'amorces pour une PCR
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[Yoyo]

Salut

Pratiquement la synthese s'effectue par des reactions de couplage chimique entre chaque nucleotides choisis. Ainsi un a un les nucleotides sont couplés les uns aux autres, mais il me semble que c'est synthetisé dans le sens inverse (3'->5').


Theoriquement tu selectionnes des regions de tailles comprises entre 18 et 25 nt qui ont une temperature d'hybridation > a 60°C idealement et dont le % en GC est aux alentours de 50% (conditions ideales). Ensuite faut s'assurer que ta sequence ne fait pas de structures secondaires, ne s'apparie pas ailleurs et ne forme pas de duplex avec ton deuxieme oligo.
Enfin il est preferable que l'exremité 3' de l'oligo (la ou commencera la reaction de polymerisation par la Taq) soit un G ou un C. pour l'extremité 5' on se moque de savoir ce qu'il y a. a l'extreme limite tu peux meme rajouter (en plus des 22nt de ton amorce) 50nt qui ne s'apparient pas du tout a ta sequence et qui seront donc insérés dans ton produit de PCR final.

YOyo

[invitea74c0747]

Yoyo à tout dit ou presque... Pour déterminer la meilleure séquence, il existe des logiciels qui te calculent tout ça... En ce qui me concerne, je choisis 3 amorces sens et 3 antisens, en respectant les critères énoncés par Yoyo, je teste les différents couples possibles et je garde le meilleur.
Ensuite il existe plusieurs fournisseurs qui te les synthétiseront, avec la qualité et la quantité souhaitée, en fonction de ton application.

[piwi]

y a aussi un site super qui te fait tout ca tout bien comme il faut.
Faut quand même penser ensuite à blaster ca dans ensembl pour voir si y a pas une redondance dans le génome (enfin là je parle pour la souris).

http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

[A voir en vidéo sur Futura]