solubilité ADN, ARN dans le phénol

[invite3adbb7c1]

Bonjour à tous

L'extraction d'acide nucléique est quelque chose de nouveau pour moi alors je cherche des infos. Aux vues de ce que j'ai trouvé sur le net, avec du phénol acide, il semble assez clair que l'ARn est dans la phase aqueuse et que l'ADN soit dans la phase phénolique (avec des traces dans la phase aqueuse). En revanche, pour l'extraction d'ADN avec du phénol basique, c'est pas vraiment clair. Des sites comme http://www.chups.jussieu.fr/polys/bi...Y.Chp.7.3.html disent que l'ARN et l'ADN sont en phase aqueuse (mais dans ce cas, qu'est ce qui élimine l'arn???) mais sinon, implicitement, on pense que l'ARN est dans la phase organique (d'où la purification différentiel des acides nucléiques en fonction du pH).
Où est la vérité???
merci d'avance

broon

PS : au passage, le chloroforme élimine les trace de phénol inhibitrice, mais les trace de chloroforme n'ont aucun effet?
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[invitec9f0f895]

Salut

le chloroforme s'evapore tres vite, d'ou l'absence de traces.

Sinon en effet on purifie les 2 en basique (adn et arn). Pour ne garder que l'adn il faut avant traiter l'echantillon avec une RNAse.

YOyo

[invite7249a892]

Si l'ARN et l'ADN sont en phase aqueuse on utilise une RNAse, DNAse free pour ne garder que les ADN.
Cordialement,
Katie.

[invite7249a892]

Oups sorry Yoyo, je n’avais pas que vous aviez répondu à la question.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite3adbb7c1]

merci de ces réponses. Une question en entrainant une autre; la méthode classique de purification d'adn est : lyse cellulaire (sds, PK) suivi de phénol/chlo et précipitation alcoolique (isoprop ou ethanol). Nulle part est fait mention d'une étape RNAse, DNAse free. Est ce que :
1/ ça ne gène pas les manip
2/ il y a tellement peu d'ARN par rapport à l'ADN
3/ on compte sur les RNAses présente partout pour finir le boulot
4/ personne n'est vraiment conscient de la présence d'arn
bonne journée

broon

[invite197fd144]

Bonjour,
En fait, il faut savoir que les ARN sont sensibles au pH alcalin et en général, l'extraction ADN se fait en phenol/Chloroforme/IAA à pH 8 et nous aurons l'ADN en phase aqueuse avec les ARN endommagés, ce qui ne gêne pas pour certaines analyses mais pas pour d'autres d'où l'action de RNase dans certains cas.
Pour l'extraction des ARNs, le P/C/IAA doit être à pH acide (~5), ce qui va dénaturer l'ADN pour se retrouver dans la phase organique et pour ne trouver que les ARN dans la phase aqueuse.
En général, les phénol commerciaux sont vendus saturés avec des solutions pour ajuster le pH du phénol (7 ou 8 ou 5 ....)
bonne extraction

[invite4bded444]

merci de ces réponses. Une question en entrainant une autre; la méthode classique de purification d'adn est : lyse cellulaire (sds, PK) suivi de phénol/chlo et précipitation alcoolique (isoprop ou ethanol). Nulle part est fait mention d'une étape RNAse, DNAse free. Est ce que :
1/ ça ne gène pas les manip
2/ il y a tellement peu d'ARN par rapport à l'ADN
3/ on compte sur les RNAses présente partout pour finir le boulot
4/ personne n'est vraiment conscient de la présence d'arn
bonne journée

broon

Et bien en fait cela dépend également du but de ta manipulation. Si tu fait une extraction d'ADN pour faire une PCR conventionnelle derrière, le fait qu'il y ait un peu d'ARN n'est pas vraiment grave. Puisque "seul" les ADN seront amplifié (je grossis la chose). Autre chose, l'ARN est très fragile et facilement dégradable. Donc, cela ne gène pas la manipulation, il y à relativement peu d'ARN, même si on peut en obtenir pas mal quand on le désire mais avec cette méthode, on ne favorise pas l'ARN. Mais encore une fois tout dépend, à mon avis, du but de l'extraction.

Ce que tu peux faire, si vraiment cela te pose un petit soucis, c'est reprendre ton ADN dans du tampon-RNAse. Comme cela tu est tranquille.

Autre chose, le fait que les ADN soient partiellement dégradés peut être un problème selon la technique utilisée après et il est vrai qu'utiliser des produits DNAse free peut être envisagé.

Voilà

Cordialement.