extraction d'ARN à partir de coupes cryostat

[invite08d5b830]

bonjour,
je cherche à extraire de l'ARN d'un bloc de tissu congelé dont il faut que je controle la morphologie. Je souhaite donc faire des coupes au cryostat, en colorer une, et faire mon extraction sur une ou plusieurs autres.

J'utilise le kit RNeasy Mini kit de qiagen. ma question est la suivante :
Puis-je faire des coupes que je congèle à -80°C avant de lyser et d'extraire l'ARN ? Ou vaut-il mieux que je lyse mes coupes, puis que je congèle le lysat à -80°C en vue d'une extraction plus tard?

Mon cryostat est dans une petite pièce ou faire les extractions n'est pas très commode...

Quelle processus dégraderait le plus l'ARN ?

Merci d'avance.
-----

[inviteb6144ea4]

Bonjour,

tu peux très bien conservés tes coupes à -80°C et faire l'extraction après. Je l'ai déjà fait et si les coupes sont très bien conservées il n'y a absolument pas de problèmes.
De plus, si tu en as la possibilité, je pense qu'avec ce kit, il vaut mieux ne pas interrompre le processus de lyse et d'extraction.

Cordialement

[invite08d5b830]

Merci Moumoutte.
Quelles sont tes conditions pour bien conserver les coupes ? (pas de décongélation, transfert rapide du cryostat dans la carboglace puis au -80°C)

Quelle épaisseur de coupe utilisais-tu ? sur quel tissu ? Quel était ton rendement d'extraction ?
Merci.

[inviteb6144ea4]

Bonjour,

j'utilisais pour ma part des coupes de 25 µm sur du tissu épithélial. La concentration en ARN total variait pas mal, en moyenne je dirai que ça donnait du 0.2 µg/µL.

Pour une bonne conservation de tes ARN, effectivement il faut éviter la décongélation / re-congélation. Si le cryostat est éloigné du -80°C il vaut mieux en effet transporter les ARN dans de la carboglace. Enfin évite de laisser "traîner" tes coupes trop longtemps dans le cryostat.

Cordialement

[A voir en vidéo sur Futura]