le système pET - surexpression de protéines

[invite759c3e8a]

Bonjour,
je ne m'ensort pas, mais alors là, vraiment pas du tout avec mes notes, quelqu'un peut m'aider à m'y retrouver?


le système pET est un plasmide qui se trouve dans une bactérie lysogène qui a alors un gène codant pour la T7 RNA polymérase et son promoteur incorporé à son génome.
on introduit alors dans cette bactérie notre gène codant pour la protéine à surexprimer.
T7 RNA pol va servir à transcrire notre gène d'intérêt
le gène de la T7 RNA polymérase est sous contrôle du promoteur lac UV5 qui s'exprime quand présence de lactose ou un de ses dérivés.
Est-ce juste?? (non, je sais):S


2)souche BL21(DE3)est une souche de bactérie nommée "BL21" et qui est infectée par le bactériophage DE3?

3)le promoteur lacUV5 est le promoteur de n'importe quelle T7 RNA polymérase ou juste celle provenant du bactériophage DE3?

4)qu'est-ce qui est sous régulation de l'opéron lactose? juste la transcription de T7 RNA polymérase ou le gène d'intérêt aussi?
et cet opéron, c'est quelque chose qu'on introduit dans la bactérie pour avoir un bon contrôle ou c'est le "vrai" opéron lactose dans lequel on introduit alors le gène codant pour la T7 RNA pol (notre gène d'intérêt?) de telle manière à ce que notre protéine soit transcrite en même temps que la bêta-galactosidase, etc ?



merci de m'éclairer
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[LXR]

Bonjour,

La question 1 est juste car lorsqu'on ajoute un dérivé du lactose, l'IPTG, qui a l'avantage de ne pas être métabolisable, on induit l'expression de la T7 RNA polymérase et du gène d'intérêt. Ceci est un mécanisme de régulation classique par l'opéron lactose qui est situé dans le promoteur de la T7 RNA polymérase (lacUV5) et dans le promoteur du gène d'intérêt.

2) Oui, le bactériophage lambda-DE3

3) Je ne sais pas

4) La transcription de la T7 RNA polymérase et du gène d'intérêt.
L'infection d'E.coli par le bactériophage lambda-DE3 a apporté à la bactérie la T7 RNA polymérase déjà sous contrôle de l'opéron lactose.

Greg

[Yoyo]

salut

Le promoteur lacUV5 est un promoteur artificiel bricolé pour l'occasion. Il est muté de maniere a le rendre moins sensible a l'AMPc. Ainsi il y a moins de fuite en absence d'induction (meme s'il y en a toujours un peu). Il est intéressant de noter que l'AMPc augmente avec la densité cellulaire. Ainsi grace au promoteur bricolé on peu cultiver a plus haute densité tout en limitant la fuite. ca peut etre particulierement utile lorsque la protéine surexprimée est toxique.

Personnellement lorsque j'ai mis la luciférase sous control du promoteur T7 je me suis rendu compte qu'effectivement dans une BL21, les activités crevaient le plafond, mais meme dans une souche DH5alpha (n'exprimant donc pas la T7) on a une activité tres importante. Ce qui montre que l'extinction du promoteur T7 est loin d'etre parfaite.

Yoyo

[invite759c3e8a]

donc, si j'ai bien compris:
1) on a une bactérie infectée par un bactériophage contenant un gène codant pour la T7 RNA pol,
2) on y intègre un promoteur artificiel lacUV5
3) on y intègre le gène d'intérêt avec un autre promoteur artificiel
et tout les deux promoteurs sont stimulables par le lactose ou un de ses dérivés

C'est juste ?

donc lacUV5 n'est pas apporté par le bactériophage comme dit LXR? c'est un morceau qui n'existait pas du tout à la base, et qu'on a fabriqué?

Yoyo, pourquoi est-ce particulièrement utile quand il s'agit de protéines toxiques? peut-être parce que la cellule pourra produire ces protéines en grande quantité d'un coup sans qu'elle n'ait eu le temps de mourir?
merciiii

[A voir en vidéo sur Futura]

[Yoyo]

Yoyo, pourquoi est-ce particulièrement utile quand il s'agit de protéines toxiques? peut-être parce que la cellule pourra produire ces protéines en grande quantité d'un coup sans qu'elle n'ait eu le temps de mourir?
merciiii

exactement! une protéine toxique empéchera ta culture d'atteindre un bon niveau de densité. Tu auras donc peu de protéines. Alors qu'une fois que tu as beaucoup de cellule, la tu induis fort ta protéine et le tour est joué (c'est pas aussi simple).

YOyo

[invite759c3e8a]

Ok merci beaucoup beaucoup!!!! Grâce à vous, j'ai pu comprendre ce truc!!