Problème avec mon western

[invite3b97760b]

Bonjour à tous !
J'ai un souci avec mon western blot sur SDS-Page, la migration et le transfert se sont bien déroulés, la première révélation de ma protéine d'intérêt s'était nickel.

Mais quand j'ai déshybridé la membrane pour hybrider l'actine, à la révélation c'était la catastrophe, j'ai eu presque pour tous les puits des mi bandes, comme si les puits étaient remplis qu'à moitié avec les protéines... je ne comprend vraiment pas !!

Est-ce que quelqu'un aurait déjà rencontré ce problème ???
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[invite71f23525]

Bonjour et bienvenue sur FSG,

Des mi bandes??? Qu'entends-tu par cette expression?

La déshybridation, je n'ai jamais trop aimé, rien ne vaut la première hybridation. Si la déshybridation ne se fait pas très bien, si l'anticorps précédent est très affin pour son antigène, il reste un fort bruit de fond et la fixation du second anticorps primaire n'est pas optimale....Dans le cas où les deux protéines ont des poids moléculaires suffisamment espacés, on peut couper la membrane entre les deux tailles attendues (grâce au marqueur de taille) et faire l'incubation de chacune des parties avec l'anticorps adéquat. Ou alors, si les deux protéines ont des tailles proches, il y a trop de risque de couper des bandes d'intérêt, donc on peut faire migrer deux gels en parallèle : un pour la protéine d'intérêt, un pour le témoin de dépôt (actine dans ton cas). Bien entendu, cela n'est pas optimal pour la normalisation par le témoin de dépôt, mais si le dépôt est bien homogène entre les deux gels et que le volume est déposé avec précision, c'est valable.

Greg

[gorben]

Salut,

Perso j'ai jamais eu un bon tampon pour deshybrider et ca n'a jamais marche correctement.
Ce que je fais maintenant c'est un mix de mes 2 Ac primaire. Comme ca, les conditions sont scrupuleusements identiques entre mon controle et ma proteine d'interet. Si les tailles sont trop proches... changer de controle interne

A+

[invite3b97760b]

heuu... au fait ce que je veux dire par des mi bandes c'est par exemple une bande qui au lieu qu'elle fasse toute la largeur du puits dans lequel elle a été déposé et bien elle ne fait plus que la moitié de la largeur... c'est bizarre comme marquage et c'est la première fois que je vois ça. il n'y a cependant pas de bruit de fond les "bandes" sont bien propres

Et puis, avec ma première révélation j'avais des bandes entières mais après déshybridation (PBS-Tween pendant 2) il n y'a plus que des moitiés.. (enfin en ce qui concerne l'actine)

sinon pour le découpage de la membrane ça va être compliqué, car ma prot fait 50kDa et l'actine est dans les 40kDa...
je vais essayer de faire 2 gels différents, mais bon ce n'est pas le meilleur choix !

merci à toi

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite71f23525]

Ou alors essaye la technique proposée par Gorben, mettre tes deux anticorps primaires dans la même solution de TBS-T lait. Mais toutefois, je te conseille de faire attention les premières fois, il faut que tu t'assures que cela ne modifie pas, pour x raisons, le profil de ton western.
Personnellement, je suis dans le même cas que toi au niveau de la taille des protéines, je coupe juste en-dessous des 50 kDa. Pour rester droit, je dépose du marqueur sur les deux côtés de mon gel ce qui me permet d'avoir deux points de repère pour couper. Je réalise la séparation sur du 10% et j'ai empiété sur une ou deux bandes qu'une seule fois en coupant .

Greg

[invitec9f0f895]

Salut

la technique proposée par Gorben est bonne, sauf si tu fais ton western pour la premiere fois et que tu ne sais pas comment tes AC I réagissent. Car si jamais ils donnent des bandes aspécifiques et que manque de bol tu en as aux alentour du poid moléculaire d'une de tes protéines tu risques d'interpréter un artéfacte, il faut donc etre tres vigilant.

Yoyo

[invite3b97760b]

merci à tous pour vos conseils
c'est décidé le prochain western ça sera les 2 Ac primaires en même temps !! à priori je m'attend à avoir 2 bandes très proches pour ma prot d'intérêt (2 isoformes) qui sont autour de 70 kDa et puis je ferais l'actine qui est à 40 kDa.. à priori ça ne va pas déranger ! enfin je verrais bien.... à suivre !!!!
merci encore