Problème lors de la transformation avec DH5a E.coli.

[invite4ad23734]

Bonjour,
Je viens poster ma toute première question, en espérant recevoir des réponses
Je vous explique mon problème:
Après extraction de mes bandes d'ADN obtenu sur gel, j'ai réalisée une purification avec le kit nucléoSpin Extract II de Macherey Nagel. Ensuite j'ai vérifiée sur gel que je n'avais pas perdu trop en quantité d'ADN pour la ligation. J'ai donc effectué la ligation sur vecteur de clonage pGEMT-easy de Promega en laissant une nuit à 4°C puis T°ambiante. Puis réalisation d'une transformation après électroporation sur DH5a E.coli. Ensemencement sur gélose LB + ampicilline de 200µL de culture + XGAL et IPTG et incubation 24h à 37°C.
Malheureusement, le lendemain aucune colonie sur les boîtes. J'ai refais toutes les manipulations plusieurs fois et je ne sais pas si s'est un problème lors de la ligation ou de la transformation.
Voila, merci pour d'éventuelles réponses.
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[invitee7a3aaed]

Salut,

Je pense que tu peux pas trop savoir si c'est la ligation ou la transformation. (En tout cas, au vue de mes faibles connaissances, je ne vois pas de moyen de le savoir)

Si je ne me trompe pas, ton facteur de sélection est l'ampiciline. (le vecteur que tu veux insérer le possède, alors que ton plasmide à l'origine non.)
Si tes E.coli ne poussent pas sur LB + Ampi, c'est qu'elles ne possèdent pas le facteur de résistance.
Donc soit le vecteur ne s'est pas intégré au plasmide, soit le le plasmide recombiné n'est pas "entrer" dans E.coli.

Essaye de changer de protocole de tranformation puis de ligation. Si en changeant la transfo, ça fonctionne c'est que c'était ça. Pareille pour la ligation.

J'ai travaillé sur E.coli DH5a, et je me souviens que si par miracle elle poussait après ligation+transformation, après une amplification, j'avais de très faible quantité d'ADN. Donc la bactérie est peut être aussi pourrite pour ce genre de chose.

Bonne chance

[gorben]

Salut,

Le pGEMT-easy est un plasmide lineaire. Si tu n'as pas d'insert d'insere pour le circularise normalement le background est proche de zero. C'est ce que tu obtiens.
Tu as deux choses a faire.
La premiere est de verifier que tes cellules sont competantes (transformation d'un plasmide circulaire connus ~ 50 ng, genre pUC, pBR, etc).
La deuxieme c'est de verifier si ton produit PCR est correct. Perso je pense que le probleme vient de la. Est ce que tu as utilise une enzyme proofreading (haute fidelite?). Le principe du pGEMT c'est de cloner le produit PCR via le A en 3' que la polymerase rajoute systematiquement a la fin de l'elongation. Si tu as une enzyme avec une activite proofreading, pas de A de rajoute et donc pas de clonage. De plus generalement pour ce genre de clonage il ne faut pas purifier le produit PCR (ou alors rajouter les A apres la purif).

A+

[piwi]

Je me demande si les DH5a sont capables d'être électro compétantes. On ne peut pas prendre n'importe quelle bactérie pour faire tout ce que l'on veut. Bon c'est un point sur lequel j'ai un doute mais je vous en laisse le bénéfice.

Sinon plus classiquement, vous récupérez vos bandes avant purif directement dans le gel avec le BET. Right? Or le BET est une saloperie pour les clonages. Ce qu'il vaudrait mieux faire c'est un gel sans BET où vous déposez votre échantillon en deux fois. Une fois bien concentrée et une fois juste un aliquote. Après la migration vous découpez la bande aliquote que vous colorez extemporannément au BET. Vous l'enroulez dans du saran et vous allez sous votre lampe UV. En recomposant le gel vous allez pouvoir découper la bande échantillon par comparaison avec la position de la bande aliquote. Votre clonage sera sans doute plus efficace.

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite4ad23734]

Merci pour votre aide,
pour l'instant je vais refaire la ligation avec des volumes différents. Je pense que les bactéries DH5a E.coli n'est pas la source du problème. Se serai peut être la quantité d'ADN ou d'enzyme lors de la ligation.
Encore merci et je file me remettre au travail

[inviteb94d8e21]

Pour faire le diagnostic d'un clonage foiré, c'est mieux d'avoir systématiquement inclus les bons contrôles :

1 contrôle de transformation, avec une dizaine de picogrammes de pUC18 ou équivalent pour des bactos électrocompétentes qui sont attendues à une efficacité de 10^8 colonies par ug de plasmide.

1 contrôle sans le fragment avec ligase, qui donne le bruit de fond du vecteur qui était mal coupé ou recisrcularisé sans insert.

1 contrôle sans le fragment et sans ligase qui permet de discriminer si le bruit de fond vient d'une mauvaise digestion ou d'une mauvaise déphosphorylation (ce témoin n'est pas très utile avec des vecteurs "dT overhang" tels que pGEMT-easy).

J'ajoute toujours un point sans ADN dans ma transfo pour vérifier que rien n'est contaminé par un plasmide ou une bactérie AmpiR. en 25 ans de clonage, ce témoin est sorti positif deux fois. Le risque est faible mais pas nul.

Dans ton cas, le plus vraisemblable est que tes bactos ne sont plus aussi compétentes qu'elles devraient. Si toutefois tu trouves une valeur de compétence correcte (>10^7/ug), c'est vraisemblablement ta ligation qui a foiré. Je suis d'accord avec piwi, le BEt, ce n'est pas ce qu'il y a de mieux pour les clonages. Pas tellement à cause de son caratcère intercalant mais parce que ça t'oblige à aller découper to gel sous les UV et que ce n'est pas très bon pour l'ADN... En plus, le BEt c'est pas terrible pour la santé.

Nous utilisons le SYBRsafe depuis 5 ans (on peut le voir sous un dispositif à lumière bleue qui peut être facilement bricolé, pas besoin d'acheter le transilluminateur hors de prix d'Invitrogen), nous avons mené des clonages en parallele pour comparer BEt vs SYBRsafe et il y a presque deux logs d'écart en efficacité de transfo entre un plasmide religué en présence de BEt et le même en présence de SYBRsafe.

Disclaimer : Je précise que je n'ai aucun lien avec les boîtes qui revendent ce produit.

[gorben]

Merci pour votre aide,
pour l'instant je vais refaire la ligation avec des volumes différents. Je pense que les bactéries DH5a E.coli n'est pas la source du problème. Se serai peut être la quantité d'ADN ou d'enzyme lors de la ligation.
Encore merci et je file me remettre au travail

Normalement dans le kit tu devrais avoir un plasmide controle a transformer. Il faut vraiment que tu verifies tes cellules, ca arrive tres souvent.

Autre question, clones tu quelque chose de potentiellement toxique? Si non, ton probleme vient de ton ADN (mais pas de la quantitee). Un T-cloning marche au poil, si ca ne marche pas c'est que ton ADN est mauvais (BET/UV) ou que tes A sont partis (et ca c'est tres tres tres frequent).

Quelle enzyme utilises tu pour la PCR?

A+

[invite4ad23734]

J'ai bien vérifié, l'enzyme que j'utilise n'a pas d'activité proofreading, elle n'élimine pas le A nécessaire à la complémentarité au vecteur. Je pense finalement que le kit que j'utilise pour la ligation est pourri donc j'ai réessayer avec une autre enzyme (+ son tampon) que celui du kit. Je verai bien après transformation si j'obtient des colonies.
Les bactéries ont été contrôlées et ne posent pas de problème.