Culture primaire de monocytes

[invite7d0481ff]

Bonjour à tous,

Je cultive des monocytes issus du sang périphérique humain en RPMI 10 % Sérum de Veau Foetal, 1 % pénicilline/streptomycine supplémenté de 500 U/ml de GM-CSF et de 50 U/ml d'IL-4. 80 millions de ces monocytes ont été mis en culture, et à J5 je n'ai récupéré que 13 millions ! Une partie des cellules ne différencie pas et reste collée au fond de la plaque 6 puits et la viabilité cellulaire chute considérablement (seulement 60 % de viabilité). Pouvez-vous m'aider à trouver une solution à ce problème ? Merci d'avance!

Alex
-----

[invite71f23525]

Bonjour et bienvenue sur Futura,

Il est normal que des cellules issues de sang périphérique meurent pour la plupart dans un milieu de culture. Cela aurait été plus inattendu si les cellules était issu d'une lignée déjà établie en culture. La population cellulaire devrait se stabiliser à un moment donné puis augmenter. Par contre si tu veux garder tes cellules sur le long terme, il faudra peut-être penser à les immortaliser car à force de se diviser elles atteindront la phase de crise télomérique et entrer en apoptose. Revient nous voir pour nous tenir au courant.

Greg

[invite7d0481ff]

Bonjour et merci pour votre réponse.
En fait, les monocytes ne se divisent pas, donc le but est seulement de les maintenir en vie et de les faire différencier. D'habitude nous n'avons pas autant de perte à J5, donc la question se dirige plus vers un problème technique (température...?) et/ou un problème de cytokines,nous avons changé de marque mais la concentration reste la même...

[invite71f23525]

Des lignées de monocytes existent en culture cellulaire. Peut-être faut-il les transformer pour qu'ils puissent se diviser sans différenciation, je pensais qu'ils pouvaient spontanément proliférer en culture, d'où ma réponse, désolé.

Greg

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitea069fc56]

Bonjour et merci pour votre réponse.
En fait, les monocytes ne se divisent pas, donc le but est seulement de les maintenir en vie et de les faire différencier. D'habitude nous n'avons pas autant de perte à J5, donc la question se dirige plus vers un problème technique (température...?) et/ou un problème de cytokines,nous avons changé de marque mais la concentration reste la même...

Revoir ce que vous avez changé par rapport à ce que vous faisiez avant pourrait peut-etre aider à diagnostiquer le problème.

Qu'en est-il de de la contamination (mycoplamse...etc),
le CO2 est bien reglé...?
Le volume de la culture; trop grand trop petit....! J'ai pas fait de culture primaire des cellules, mais secondaire seulement et pour des cellules immortalisées à des concentration beaucoup moins de ce que tu dis ! Du coup, est-ce la concentration de 80 millions de cellules par rapport au volume utilisé est proportionnelle?